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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 小球藻中酶活的测定
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wosudongyang

铜虫 (初入文坛)

[求助] 小球藻中酶活的测定 已有1人参与

小弟在尝试测定小球藻中光合作用相关酶的一些酶活，目前有：
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9)
苹果酸脱氢酶
葡萄糖—6—磷酸脱氢酶
这三种一直没有结果；
我测定方法基本就是离心取藻泥，ddH2O 洗涤，液氮研磨，最后按照《工具酶的活力测定》书上的步骤测定，
可是结果都是没有酶活体现，酶反应曲线根本没有变化，不知是何原因？
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1楼 2015-05-30 11:15:53
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶反应曲线根本没有变化，或者是酶的提取有问题，导致了酶的失活，或者是底物不合格，还有就是检测仪器的问题，希望你详细些说一下，我们可以讨论。
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2楼2015-06-01 12:49:15
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wosudongyang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-01 12:49:15
酶反应曲线根本没有变化，或者是酶的提取有问题，导致了酶的失活，或者是底物不合格，还有就是检测仪器的问题，希望你详细些说一下，我们可以讨论。

提取应该没问题吧，别的还有几种酶能测出来，步骤的话是：
1.        加Tris-HCl缓冲液
2.        加MgCl2溶液
3.        加NADP+溶液
4.        加尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖溶液
5.        加a-葡萄糖磷酸变位酶溶液
6.        加葡萄糖—6—磷酸脱氢酶溶液
7.        加入待测液（空白管加纯水）
8.        迅速加入无机焦磷酸盐溶液，
立即混匀开始计时
在30℃恒温条件下，如上表加试剂，反应总体积为1.0ml。然后使用紫外分光光度计，选择波长未340nm，测定光吸收值。以纯水校正光吸收到0点，每隔半分钟读取各管光吸收（A），共读3min，以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算出每分钟A的增加值为ΔA340nm/分=ΔA样/分-Δ空/分
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3楼2015-06-01 14:11:52
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我初步看，好像还没有明显的问题。你适当调整一下酶的反应温度和适当温和操作混合一下酶和底物，并且改变酶的浓度。我今天我这里没有带酶的活性测定手册，我明天查一下实验手册。
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wosudongyang
4楼2015-06-01 14:21:17
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wosudongyang

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-01 14:21:17
我初步看，好像还没有明显的问题。你适当调整一下酶的反应温度和适当温和操作混合一下酶和底物，并且改变酶的浓度。我今天我这里没有带酶的活性测定手册，我明天查一下实验手册。

这边改变酶的浓度具体是指提取液浓度提高之类的吗？谢谢啦
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5楼2015-06-01 14:22:50
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有注意初次反应的温度和试剂的添加顺序，最后问一句，这三种酶没有过期失活吗？我明后天查到酶的活性测定实验手册再来具体讨论。
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6楼2015-06-01 14:23:28
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116小破孩

新虫 (正式写手)
楼主，你测这些酶的活性是想做毒理方面的实验吗

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7楼2015-12-07 23:17:00
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