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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切问题
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yydr

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切问题 已有6人参与

为什么我的pet载体与目的片段经双酶切后与目的片段连接，竟然是空载体？双酶切后不是不容易出现空载吗

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-05-28 15:46:43
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-05-28 20:58:47
酶切不完全导致的，这是完全可能的。
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3楼2015-05-28 17:01:41
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普通回帖

a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-05-28 20:58:39
双酶切也会有酶切不完全的情况，出现空载体也是有可能的，建议你酶切的量稍微少点，然后酶切的时间稍微啦长点，再切胶回收。
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2楼2015-05-28 15:55:04
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yydr

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by a13515517892 at 2015-05-28 15:55:04
双酶切也会有酶切不完全的情况，出现空载体也是有可能的，建议你酶切的量稍微少点，然后酶切的时间稍微啦长点，再切胶回收。

量少容易回收回来的太暗啊，

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4楼2015-05-28 22:08:09
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yydr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-05-28 17:01:41
酶切不完全导致的，这是完全可能的。

是只有单酶切，所以又连起来了？可是提的pet质粒扩目的条带，和酶连后提出质粒扩的片段不一样啊

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5楼2015-05-28 22:09:39
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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4楼: Originally posted by yydr at 2015-05-28 22:08:09
量少容易回收回来的太暗啊，
...

我是建议他适当的减少，因为他的酶切已经出现酶切开的了，说明质粒量多了哦
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6楼2015-05-29 07:41:59
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qspyyy

木虫 (职业作家)

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也会出现哒而且跟你转化的菌有很大关系

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喜欢实验。。。不喜欢写文章。。。
7楼2015-05-29 10:55:10
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yydr

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by qspyyy at 2015-05-29 10:55:10
也会出现哒而且跟你转化的菌有很大关系

我是转BL21的，而且我有一个先转的dh5a提质粒再转BL21,长出转化子提质粒竟然提出很多条条带，而且都很亮

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8楼2015-05-29 11:33:19
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yydr

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by a13515517892 at 2015-05-29 07:41:59
我是建议他适当的减少，因为他的酶切已经出现酶切开的了，说明质粒量多了哦...

我的单酶切和双酶切大小看不出来，但是都跟没有切的原质粒有差别，我切的时候没有完全切开，我就回收的看起来是切开的位置，难道这个位置有单酶切的？但是我切的时间够久，就算有单酶切的，双酶切载体也应该很多啊，不至于三十几个转化子都是空载啊？

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9楼2015-05-29 11:36:02
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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9楼: Originally posted by yydr at 2015-05-29 11:36:02
我的单酶切和双酶切大小看不出来，但是都跟没有切的原质粒有差别，我切的时候没有完全切开，我就回收的看起来是切开的位置，难道这个位置有单酶切的？但是我切的时间够久，就算有单酶切的，双酶切载体也应该很多啊 ...

朋友，首先要保证你的酶好用，是否过期，最好用NEB的酶（不是打广告，用过的都知道好用）其次就是我觉得哪怕回收回来的酶切载体只是带了一点质粒，你想想是转化质粒效率高还是连接的效率高（同样的载体情况）。
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10楼2015-05-29 11:57:42
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