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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切问题
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xmcliulei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
正常，一般是由于两个酶的切割效率不同导致的单酶切，在连接过程中单酶切的载体自连产生空载~可以试试分部切割~
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11楼2015-05-29 23:50:21
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ZY930305
顶

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12楼2015-05-29 23:59:43
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很明显自连是载体上只切了一刀，另一刀没及时切上所致。
建议:
1 把两个酶的说明书拿出来看看分析一下相应buffer下哪个酶效率低一些可适当增加酶量，同时适当延长切割时间。
2 在你们实验室找一找有没有已经在你那两个酶切位点中间成功连上其他基因的重组质粒，直接借过来双酶切割胶回收即可得到两端粘性末端的质粒

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yydr yydr
大家相互帮助哈
13楼2015-05-30 01:02:25
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yydr

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-30 01:02:25
很明显自连是载体上只切了一刀，另一刀没及时切上所致。
建议:
1 把两个酶的说明书拿出来看看分析一下相应buffer下哪个酶效率低一些可适当增加酶量，同时适当延长切割时间。
2 在你们实验室找一找有没有已经在你 ...

嗯嗯，这次已经增长时间了，有个问题还想请教，就是为什么我把酶连好的产物先转dh5a,提质粒后再转bl21,再提质粒就是很多条条带呢

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14楼2015-05-30 09:17:22
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yydr

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-30 01:02:25
很明显自连是载体上只切了一刀，另一刀没及时切上所致。
建议:
1 把两个酶的说明书拿出来看看分析一下相应buffer下哪个酶效率低一些可适当增加酶量，同时适当延长切割时间。
2 在你们实验室找一找有没有已经在你 ...

谢谢了啊，这次已经延长酶切时间试试了啊

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15楼2015-05-30 09:19:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by yydr at 2015-05-30 09:17:22
嗯嗯，这次已经增长时间了，有个问题还想请教，就是为什么我把酶连好的产物先转dh5a,提质粒后再转bl21,再提质粒就是很多条条带呢
...

提出来的质粒只要超螺旋带比较明显，位置相当就行，你描述中的很多带肯定是在你质粒大小位置朝上分布的，其实就是一些开环条带，不影响后期实验，实在不放心你可以再做一个单酶切和双酶切，那些带基本都会消失，显出的条带的应该都是正确的位置！
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yydr
大家相互帮助哈
16楼2015-05-30 12:46:31
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高洁琼

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先我不知道你是否用软件查看了你选的两种酶在载体中是独一无二的，或者说酶切后的条带是怎样的…你是否进行了对比确认。其次，如果是酶切效率问题，建议分步酶切，首先使用一种酶单切，回收后再用另一种酶单切回收…最后，也有可能是连接效率太低，我不知道你用的是什么连接酶，我是用T4酶连接过夜的。最最后，不知道你在转化时做了阴性对照没，如果对照组中有大量克隆，说明载体自连接泛滥哈，此时转化前要抑制自连接…

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Nothing~seek,nothing~find.
17楼2015-05-30 14:50:49
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yydr

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-30 12:46:31
提出来的质粒只要超螺旋带比较明显，位置相当就行，你描述中的很多带肯定是在你质粒大小位置朝上分布的，其实就是一些开环条带，不影响后期实验，实在不放心你可以再做一个单酶切和双酶切，那些带基本都会消失，显 ...

不是的，我提出的条带在目的条带上下大小都有，而且很多条，但是我送出去测序发现插入片段是对的，但是提出的条带真的是很多条，远远超过4 5条

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18楼2015-05-30 23:42:38
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yydr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 高洁琼 at 2015-05-30 14:50:49
首先我不知道你是否用软件查看了你选的两种酶在载体中是独一无二的，或者说酶切后的条带是怎样的…你是否进行了对比确认。其次，如果是酶切效率问题，建议分步酶切，首先使用一种酶单切，回收后再用另一种酶单切回收 ...

谢谢啊，请假下怎么抑制自连接啊

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19楼2015-05-30 23:44:46
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by yydr at 2015-05-30 23:42:38
不是的，我提出的条带在目的条带上下大小都有，而且很多条，但是我送出去测序发现插入片段是对的，但是提出的条带真的是很多条，远远超过4 5条
...

我认为没啥问题，你可以做一下单酶切，只要切出来是一条带就没问题
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大家相互帮助哈
20楼2015-05-31 00:40:15
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