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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母GS115表达，用博来霉素筛选对照和转化都长菌落是什么原因？
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caichenggu

铁虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母GS115表达，用博来霉素筛选对照和转化都长菌落是什么原因？ 已有2人参与

我用毕赤酵母GS115表达蛋白，用化学转化法转化以后，转化和对照都长出了很多菌落，刚开始怀疑是抗生素的问题，现在换了新买的还是老样子，不知道问题出在哪里，各位大神有没有遇见过这种问题啊？？
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1楼 2015-05-26 21:37:47
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:17:36
GS115用遗传霉素不用博来霉素，你确定你没用错？

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2楼2015-06-07 13:46:00
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
你用的是什么载体啊？如果是za系列的话，虽说是博来霉素筛选，但是低浓度的博来霉素确实也能长空载，原因我也不明白。同时设几个浓度梯度，然后以pcr鉴定为准。肉眼观察板子不靠谱。我也正在做这个……

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3楼2015-06-07 13:49:56
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-06-08 13:18:19
确定终浓度是100ug/ml吗？zeocin是在哪买的？倒平板的时候温度高不高？对照组长出来的菌落颜色如何？确定对照长的是酵母而不是杂菌吗？

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大家相互帮助哈
4楼2015-06-07 20:09:49
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caichenggu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-06-07 13:49:56
你用的是什么载体啊？如果是za系列的话，虽说是博来霉素筛选，但是低浓度的博来霉素确实也能长空载，原因我也不明白。同时设几个浓度梯度，然后以pcr鉴定为准。肉眼观察板子不靠谱。我也正在做这个……
...

嗯，我已经做pcr验证了

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5楼2015-06-08 12:55:58
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caichenggu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-07 20:09:49
确定终浓度是100ug/ml吗？zeocin是在哪买的？倒平板的时候温度高不高？对照组长出来的菌落颜色如何？确定对照长的是酵母而不是杂菌吗？

博莱霉素筛的不怎么精确

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6楼2015-06-08 12:57:09
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

晞朔: MolEPI+1 2015-06-09 11:13:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by caichenggu at 2015-06-08 12:57:09
博莱霉素筛的不怎么精确
...

zeocin 100ug/ml对照组我试过很多次是可以不长空载的。索莱宝提供的说明书上写的很清楚，50ug/ml就可以把酵母菌筛掉了，所以Za说明书上的100ug/ml用来筛单拷贝是够用了的。
如果对照出现大量菌落。
1.抗生素的问题 如果买的是瓶装固体zeocin用的时候需要溶解分装，那配置的抗生素的终浓度够不够，向平板里加抗生素是否均匀，如果在倒平板前加抗生素，培养基的温度是否过高等，而且zeocin对光敏感，配好的zeocin需要避光保存，加好抗生素的平板也尽量避光的，不知道你用的是什么牌子的zeocin
2.涂板涂的过浓或者没涂开，配合以上问题就可能出现对照长菌，但是如果大量长菌，不排除你宿主菌本身就污染杂菌的可能。

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7楼2015-06-08 13:50:14
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caichenggu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-08 13:50:14
zeocin 100ug/ml对照组我试过很多次是可以不长空载的。索莱宝提供的说明书上写的很清楚，50ug/ml就可以把酵母菌筛掉了，所以Za说明书上的100ug/ml用来筛单拷贝是够用了的。
如果对照出现大量菌落。
1.抗生素的问 ...

菌种没有问题，其他应该也没有问题，但是还是长，我估计可能是抗生素有效期有限制
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8楼2015-06-08 16:27:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by caichenggu at 2015-06-08 16:27:12
菌种没有问题，其他应该也没有问题，但是还是长，我估计可能是抗生素有效期有限制...

倒的平板尽量不要在光下放置太长时间，培养箱如果透光就用纸给贴起来，

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9楼2015-06-08 16:53:33
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