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lvbobo823铁杆木虫 (正式写手)
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[求助]
GUS染色问题 已有2人参与
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各位虫友们： 最近做小麦花穗的GUS瞬时表达，发现各组织都被染上。 具体做法是取小麦幼穗分别剥取花药，花粉，内稃，萼片等在高渗培养基上处理4小时后进行基因枪轰击，先轰击只含金粉的对照，再分别轰击含有目的片段的质粒。两天后进行染色，发现不管对照还是含有目的载体的雌蕊都染成蓝色，其他组织部分染上色。我用的启动子是雌蕊特异表达的。 GUS染液成分（50 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4, 0.4 mM K3[Fe(CN6)], 0.4 mM K4[Fe(CN6)], 8 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 20% 甲醇, 1mg/ml X-gluc）样品37度过夜孵育，70%酒精脱色2-3次后观察。 希望各虫友帮忙解决一下染色不特异情况，另外问一下小麦GUS染色有没有别的特殊要求？应该怎样做，望各位大神不吝指教，不胜感激。 注：GUS基因对比是跟pGWB3一致。再一个我发现只要材料有损伤的地方容易被染上色。 谢谢各位虫友帮忙！这问题困扰我老长时间了。 |
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 虫友问答-分子生物 |
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wxf8470
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【答案】应助回帖
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lvbobo823: 金币+20, ★★★很有帮助, 方法说明很详细，帮助很大 2016-10-28 14:06:29
lvbobo823: 金币+20, ★★★很有帮助, 方法说明很详细，帮助很大 2016-10-28 14:06:29
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检测过不轰击的吗?另外能找到阳性对照吗? 最简单的是换GUS染色方法, 以下是我用过的，很好用，阴性对照没出现过。 转基因烟草叶片剪碎，经90％丙酮冰浴30 min，室温下1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)（配方后附）洗两次，每次15 min，之后加入GUS组织化学染色反应液（配方后附），37℃避光温育24 h。倒掉反应液，70％乙醇4℃固定几小时，95%乙醇脱色，照相。 1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)(1000 mL)： NaH2PO4 38.9 g Na2HPO4 258.12 g 调pH值到7.2，ddH2O定容至1000 mL，121℃灭菌20 min。 0.2 mol/L NaH2PO4 (pH7.0) (100 mL)： 3.12 g NaH2PO4•2H2O溶于灭菌ddH2O中，定容至100 mL 0.2 mol/L Na2HPO4 (pH7.0) (100 mL)： 7.17 g NaH2PO4•12H2O溶于灭菌ddH2O中，定容至100 mL GUS组织化学染色反应液(20 mL)： 0.2 mol/L NaH2PO4 (pH7.0) 5mL 0.2 mol/L Na2HPO4 (pH7.0) 5mL EDTA (0.5 mol/L ，pH8.0) 5mL Tween-20 80μL K3[Fe(CN)6] (170 mmol/L) 118μL K4[Fe(CN)6] (170 mmol/L) 118μL X-Gluc (20mg/mL) 1mL 加ddH2O定容至20 mL，分装后-20℃贮存。 |
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snhajn
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