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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 酵母双杂交
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yangfen007

铁虫 (初入文坛)

[交流] 酵母双杂交 已有6人参与

本人最近在做酵母双杂，用Y187和AH109菌株，转质粒PGBKT7和PGADT7.用的是热激转化方法：
1)        在1.5 mL预冷的离心管中加入100 ng转化的质粒（诱饵载体）DNA和10 μL已变性的10mg/mL的鲱鱼精DNA（Herring testes Carrier DNA）并充分混匀；
2)        加入100 μL酵母感受态细胞，轻轻混匀；
3)        加入600 μL PEG/LiAc溶液，轻轻震荡混匀后置于30℃热板上30 min，每10 min摇匀一次；
4)        加入70 μL DMSO，轻轻点到混匀；
5)        42℃热板上15 min，每5 min摇匀一次；
6)        冰上放置1-2min，12000 rpm离心15 s，去上清；
7)        加入1 mL YPD Plus Liquid Medium，高速离心15 s，去上清；
8)        加入1 mL 0.9% NaCl溶液，涂布于一缺平板SD/-Trp上，30℃培养，2-3天
现在出现的问题是SD/-Trp不长，转了好多次都不行，求有经验的朋友指导一二，不甚感激啦！
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星空物语星空

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1楼 2015-05-23 22:51:22
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本草纲目0503

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-06-24 12:16:21
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-24 08:54:57
你为什么不按clontech的要求来，出问题很正常啊

你好，我是根据clontech的说明书上来操作的，但酵母一直摇不起来。第一步挑一个酵母单菌落在YPDA液体培养基上培养8—12hr能长起来，可是在第二步转移5ul到新的YPDA培养基上培养16—20hr却总是不到规定的OD值。
      有一次划线保存，发现在YPDA固体培养基上，AH109菌株变红，但相同的板上另一侧的Y187没有变红，难道是菌株老化变异吗？可是后来从别的实验室借来GOLD菌株仍然摇不起来。。。
      这个问题已经困扰我很久了，耽误了两个月的时间，希望您能帮我分析一下，不胜感激！
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3楼2015-06-23 18:43:55
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你为什么不按clontech的要求来，出问题很正常啊

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-05-24 08:54:57
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Neo2000

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 本草纲目0503 at 2015-06-23 18:43:55
你好，我是根据clontech的说明书上来操作的，但酵母一直摇不起来。第一步挑一个酵母单菌落在YPDA液体培养基上培养8—12hr能长起来，可是在第二步转移5ul到新的YPDA培养基上培养16—20hr却总是不到规定的OD值。
   ...

这个很正常啊

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4楼2015-06-23 21:40:36
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本草纲目0503

新虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-06-23 21:40:36
这个很正常啊
...

那怎样才能解决这个问题呢？
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5楼2015-06-24 11:39:14
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liweiwei0325

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先你的菌株划线之后，至少要长3-7天，单菌落有黄豆大小时再开始试验，还有加 YPD Plus Liquid Medium后需要继续摇菌至少一个小时，才能使酵母细胞复苏，希望能帮到你
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6楼2015-12-24 10:36:47
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星空物语星空

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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请问你使用的YPD Plus Liquid Medium 是怎么配的，还是说买的试剂盒。
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7楼2016-04-14 13:01:50
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veii—W

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 星空物语星空 at 2016-04-14 13:01:50
请问你使用的YPD Plus Liquid Medium 是怎么配的，还是说买的试剂盒。

同问，请问你知道配方了吗
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8楼2017-06-15 18:15:46
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veii—W

新虫 (初入文坛)
求问 YPDA plus 培养基配方
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9楼2017-06-15 18:16:14
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雕刻你的拾光

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 本草纲目0503 at 2015-06-23 18:43:55
你好，我是根据clontech的说明书上来操作的，但酵母一直摇不起来。第一步挑一个酵母单菌落在YPDA液体培养基上培养8—12hr能长起来，可是在第二步转移5ul到新的YPDA培养基上培养16—20hr却总是不到规定的OD值。
   ...

AH109菌株易老化，我做的时候摇过了就会变红
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10楼2018-09-11 10:05:18
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