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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

[求助] 细胞单克隆筛选---愁死我了 已有2人参与

小弟现在正在筛细胞单克隆,用的是吉玛公司合成的pGPU6/GFP/Neo干扰载体,筛了7天之后克隆已经长出来了,而且荧光比较亮,克隆状态也挺好。但是过了几天,克隆的绿色荧光就逐渐减弱,今天看的时候基本上没有荧光了,这是为什么!?我都奔溃了。
还有我同时筛的DOX诱导过表达载体,双载体的单克隆实在是难筛。我都筛了两个月了,还没有出阳性克隆,请问各位有什么好的方法能够提高双载体筛选效率。
以上两个问题,如果能给出一些建议,感激不尽~!
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-05-06 13:04:47
瞬转siRNA 长一段时间,就会丢失,你被他们忽悠了吧
2楼2015-05-06 09:05:42
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-05-06 13:04:54
单克隆筛选现在有个产品挺好的,cell plaza 利用共培养的方式去筛选单克隆
3楼2015-05-06 09:09:51
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-05-06 09:05:42
瞬转siRNA 长一段时间,就会丢失,你被他们忽悠了吧

这个是干扰载体,不是小RNA,说明说上写的可以进行克隆的筛选
4楼2015-05-06 13:05:50
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你是只要在这个细胞里表达一个荧光标签是吧,而且是稳定转染的细胞株?
5楼2015-05-06 13:08:06
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-05-06 13:08:06
你是只要在这个细胞里表达一个荧光标签是吧,而且是稳定转染的细胞株?

不是,这是个干扰载体,含有干扰小片段和GFP,分别用不同的启动子
6楼2015-05-06 15:56:09
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小刀188

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by KEVIN_LOVE at 2015-05-06 15:56:09
不是,这是个干扰载体,含有干扰小片段和GFP,分别用不同的启动子...

还是做一下Cas9吧,直接敲除了,省着麻烦
7楼2015-05-06 17:29:58
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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KEVIN_LOVE: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-05-09 21:20:14
荧光过一段时间就会消失,老板曾经讲过是因为设计的时候选用了双顺反子什么的,不过没有关系,只要两端存在UTR序列,就能够稳定整合进基因组。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
8楼2015-05-08 18:20:23
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-05-08 18:20:23
荧光过一段时间就会消失,老板曾经讲过是因为设计的时候选用了双顺反子什么的,不过没有关系,只要两端存在UTR序列,就能够稳定整合进基因组。

你们也是用的这种载体吗?
9楼2015-05-12 10:37:08
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

楼主问题解决了吗?是否成功筛选稳定细胞株了,双载体筛了两个月也没有一个单克隆是要奔溃啦,楼主是用什么方法筛的额,用的是什么抗性,最后筛出来了么,有没有什么好的建议。。。
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-11-09 11:15:42
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