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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞单克隆筛选---愁死我了
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

[求助] 细胞单克隆筛选---愁死我了 已有2人参与

小弟现在正在筛细胞单克隆，用的是吉玛公司合成的pGPU6/GFP/Neo干扰载体，筛了7天之后克隆已经长出来了，而且荧光比较亮，克隆状态也挺好。但是过了几天，克隆的绿色荧光就逐渐减弱，今天看的时候基本上没有荧光了，这是为什么！？我都奔溃了。
还有我同时筛的DOX诱导过表达载体，双载体的单克隆实在是难筛。我都筛了两个月了，还没有出阳性克隆，请问各位有什么好的方法能够提高双载体筛选效率。
以上两个问题，如果能给出一些建议，感激不尽~！
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1楼 2015-05-05 23:15:10
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-06 13:04:47
瞬转siRNA 长一段时间，就会丢失，你被他们忽悠了吧
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2楼2015-05-06 09:05:42
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-06 13:04:54
单克隆筛选现在有个产品挺好的，cell plaza 利用共培养的方式去筛选单克隆
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3楼2015-05-06 09:09:51
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-05-06 09:05:42
瞬转siRNA 长一段时间，就会丢失，你被他们忽悠了吧

这个是干扰载体，不是小RNA，说明说上写的可以进行克隆的筛选
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4楼2015-05-06 13:05:50
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你是只要在这个细胞里表达一个荧光标签是吧，而且是稳定转染的细胞株？
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5楼2015-05-06 13:08:06
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-05-06 13:08:06
你是只要在这个细胞里表达一个荧光标签是吧，而且是稳定转染的细胞株？

不是，这是个干扰载体，含有干扰小片段和GFP，分别用不同的启动子
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6楼2015-05-06 15:56:09
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小刀188

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by KEVIN_LOVE at 2015-05-06 15:56:09
不是，这是个干扰载体，含有干扰小片段和GFP，分别用不同的启动子...

还是做一下Cas9吧，直接敲除了，省着麻烦
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7楼2015-05-06 17:29:58
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
KEVIN_LOVE: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-05-09 21:20:14
荧光过一段时间就会消失，老板曾经讲过是因为设计的时候选用了双顺反子什么的，不过没有关系，只要两端存在UTR序列，就能够稳定整合进基因组。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
8楼2015-05-08 18:20:23
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-05-08 18:20:23
荧光过一段时间就会消失，老板曾经讲过是因为设计的时候选用了双顺反子什么的，不过没有关系，只要两端存在UTR序列，就能够稳定整合进基因组。

你们也是用的这种载体吗？
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9楼2015-05-12 10:37:08
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
楼主问题解决了吗？是否成功筛选稳定细胞株了，双载体筛了两个月也没有一个单克隆是要奔溃啦，楼主是用什么方法筛的额，用的是什么抗性，最后筛出来了么，有没有什么好的建议。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-11-09 11:15:42
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