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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

[求助] fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~ 已有4人参与

p1300-35S载体上面的kpnI以及speI两个酶切位点，用fast digest 快切酶酶切，体系

载体                  40μl
kpnI                  1μl
speI                   1μl
green buffer       5μl
ddH2O               3μl
total                  50μl

酶切30分钟，切完之后，做胶回收以及检测，看条带大小都符合预期（约10k），但是与基因做连接的时候，做了一个空载的对照，用DH5α 大肠杆菌感受态转化以后，对照空载也长了单菌落（3个），说明载体没切干净，请问这种情况下该怎么办
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
1楼 2015-05-03 20:15:15
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angel00001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+2, 谢谢评论哈，友情赠送 2015-05-04 12:29:13
这个我忘了不好意思啊

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2楼2015-05-03 20:17:07
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+3, ★有帮助, 质粒浓度也就800ng左右，我不知道这个多不多，没概念，老师说不超过1微克 2015-05-04 12:30:28
这很明显是质粒放多了，少放点质粒就OK了

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3楼2015-05-03 22:17:20
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yan_nie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:01
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量，就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下，多挑几个单克隆，用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话，一般延长酶切时间（最长可以过夜：12-16小时）就好了（之前需要上FastDigest的网站查询一下，看看所用的酶能够保持活性的时间是否足够长）。
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己欲立而立人，己欲达而达人。
4楼2015-05-03 23:49:05
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auwdh

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:05
参照那个酶的使用说明书来做最把稳了。还有可以适当延长酶切时间或者酶量。有点切不干净没事的，不影响后续回收或者链接就行了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我交出一片心，不怕你误解，谁没受过伤，谁没流过泪？
5楼2015-05-04 00:32:26
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-03 22:17:20
这很明显是质粒放多了，少放点质粒就OK了

质粒浓度一般不超过1微克，我这个总共也只有800ng，应该不多吧
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
6楼2015-05-04 08:45:25
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yan_nie at 2015-05-03 23:49:05
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量，就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下，多挑几个单克隆，用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话 ...

fast digest 这个你用的多不，说明书上说的是5-15分钟即可，我切的是30分钟，之前有酶切过夜，不过酶切后貌似载体有杂带出现，也就是可能伴随有切到其他位点的情况，这个问题你碰到过么
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
7楼2015-05-04 08:47:55
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 08:45:25
质粒浓度一般不超过1微克，我这个总共也只有800ng，应该不多吧...

实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率

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8楼2015-05-04 10:18:52
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 10:18:52
实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率
...

做连接 的话，你一般大概用多少纳克载体，多少纳克片段呀，我这个载体大概10K，片段0.7k和0.9k
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
9楼2015-05-04 12:27:19
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 12:27:19
做连接 的话，你一般大概用多少纳克载体，多少纳克片段呀，我这个载体大概10K，片段0.7k和0.9k...

我不测浓度的，你可以切个梯度，尽量少切

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10楼2015-05-04 12:28:54
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