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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 10:18:52
实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率
...

一点点是多少纳克呀
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
11楼2015-05-04 12:32:48
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 12:28:54
我不测浓度的，你可以切个梯度，尽量少切
...

切梯度，这个也可以做梯度呀，果然眼前亮了，梯度一般切几个
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
12楼2015-05-04 12:41:32
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yan_nie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 08:47:55
fast digest 这个你用的多不，说明书上说的是5-15分钟即可，我切的是30分钟，之前有酶切过夜，不过酶切后貌似载体有杂带出现，也就是可能伴随有切到其他位点的情况，这个问题你碰到过么...

我们实验室一直用FastDigest，说明书上给的时间（5-15分钟）一般是理想条件下的，但实际上经常需要更长的时间（可能的原因包括酶储存时间过长或保存不当，导致酶活度下降；质粒的某些supercoil form的构象屏蔽了内切酶的识别序列，导致酶切效率降低，等等）。
酶切后出现杂带很有可能是由于star activity（主要原因有酶切时间过长，甘油浓度高于5%），可以查一下该酶的使用说明书，用说明书上推荐的条件来设置酶切反应。
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己欲立而立人，己欲达而达人。
13楼2015-05-04 15:46:10
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小太阳zz

铁虫 (小有名气)
质粒放的太多了，就会导致自连，酶连时少放质粒，20ul的体系，我就放6.5ul的质粒，10.5ul的片段。
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走着走着，花就开了
14楼2015-05-05 11:33:36
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