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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 10:18:52
实际上你并不需要那么多吧,做连接的话只要一点点就够,不能贪多,否则阳性率低,我这边基本上可以做到接近100%的阳性率
...

一点点是多少纳克呀
天空没有留下翅膀的痕迹,我却从中飞过
11楼2015-05-04 12:32:48
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 12:28:54
我不测浓度的,你可以切个梯度,尽量少切
...

切梯度,这个也可以做梯度呀,果然眼前亮了,梯度一般切几个
天空没有留下翅膀的痕迹,我却从中飞过
12楼2015-05-04 12:41:32
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yan_nie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 08:47:55
fast digest 这个你用的多不,说明书上说的是5-15分钟即可,我切的是30分钟,之前有酶切过夜,不过酶切后貌似载体有杂带出现,也就是可能伴随有切到其他位点的情况,这个问题你碰到过么...

我们实验室一直用FastDigest,说明书上给的时间(5-15分钟)一般是理想条件下的,但实际上经常需要更长的时间(可能的原因包括酶储存时间过长或保存不当,导致酶活度下降;质粒的某些supercoil form的构象屏蔽了内切酶的识别序列,导致酶切效率降低,等等)。
酶切后出现杂带很有可能是由于star activity(主要原因有酶切时间过长,甘油浓度高于5%),可以查一下该酶的使用说明书,用说明书上推荐的条件来设置酶切反应。
己欲立而立人,己欲达而达人。
13楼2015-05-04 15:46:10
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小太阳zz

铁虫 (小有名气)

质粒放的太多了,就会导致自连,酶连时少放质粒,20ul的体系,我就放6.5ul的质粒,10.5ul的片段。
走着走着,花就开了
14楼2015-05-05 11:33:36
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