24小时热门版块排行榜    

查看: 3050  |  回复: 13
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

再闹不给糖

新虫 (正式写手)

[求助] fast digest 酶切p1300-35S载体,切半个小时切不干净是怎么回事,本人新手,求指点~~~ 已有4人参与

p1300-35S载体上面的kpnI以及speI两个酶切位点,用fast digest 快切酶酶切,体系

载体                  40μl
kpnI                  1μl
speI                   1μl
green buffer       5μl
ddH2O               3μl
total                  50μl

酶切30分钟,切完之后,做胶回收以及检测,看条带大小都符合预期(约10k),但是与基因做连接的时候,做了一个空载的对照,用DH5α 大肠杆菌感受态转化以后,对照空载也长了单菌落(3个),说明载体没切干净,请问这种情况下该怎么办
回复此楼
天空没有留下翅膀的痕迹,我却从中飞过
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

再闹不给糖

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yan_nie at 2015-05-03 23:49:05
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量,就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下,多挑几个单克隆,用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话 ...

fast digest 这个你用的多不,说明书上说的是5-15分钟即可,我切的是30分钟,之前有酶切过夜,不过酶切后貌似载体有杂带出现,也就是可能伴随有切到其他位点的情况,这个问题你碰到过么
天空没有留下翅膀的痕迹,我却从中飞过
7楼2015-05-04 08:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

angel00001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+2, 谢谢评论哈,友情赠送 2015-05-04 12:29:13
这个我忘了不好意思啊

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-05-03 20:17:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+3, 有帮助, 质粒浓度也就800ng左右,我不知道这个多不多,没概念,老师说不超过1微克 2015-05-04 12:30:28
这很明显是质粒放多了,少放点质粒就OK了

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-05-03 22:17:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yan_nie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:01
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量,就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下,多挑几个单克隆,用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话,一般延长酶切时间(最长可以过夜:12-16小时)就好了(之前需要上FastDigest的网站查询一下,看看所用的酶能够保持活性的时间是否足够长)。
己欲立而立人,己欲达而达人。
4楼2015-05-03 23:49:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 导师吐槽:我怎么摊上了这么个极品研究生! +5 苏东坡二世 2026-08-23 5/250 2026-08-27 10:39 by 炜雨
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 LIbGuocjEEYw 2026-08-26 4/200 2026-08-27 02:01 by Ie9AyIAvGbvs
[基金申请] 怎么查啊 +5 huang1991js 2026-08-26 5/250 2026-08-26 16:09 by Equinoxhua
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件,有关系吗? +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 科研孤儿太难了 +21 我4大白菜 2026-08-20 22/1100 2026-08-26 11:29 by nlgza
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了,明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
请填处理意见