应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~
141/2返回列表12下一页
查看: 3042  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

再闹不给糖

新虫 (正式写手)

[求助] fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~ 已有4人参与

p1300-35S载体上面的kpnI以及speI两个酶切位点，用fast digest 快切酶酶切，体系

载体                  40μl
kpnI                  1μl
speI                   1μl
green buffer       5μl
ddH2O               3μl
total                  50μl

酶切30分钟，切完之后，做胶回收以及检测，看条带大小都符合预期（约10k），但是与基因做连接的时候，做了一个空载的对照，用DH5α 大肠杆菌感受态转化以后，对照空载也长了单菌落（3个），说明载体没切干净，请问这种情况下该怎么办
回复此楼

» 猜你喜欢
天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
1楼 2015-05-03 20:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

angel00001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+2, 谢谢评论哈，友情赠送 2015-05-04 12:29:13
这个我忘了不好意思啊

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2015-05-03 20:17:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
再闹不给糖: 金币+3, ★有帮助, 质粒浓度也就800ng左右，我不知道这个多不多，没概念，老师说不超过1微克 2015-05-04 12:30:28
这很明显是质粒放多了，少放点质粒就OK了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2015-05-03 22:17:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yan_nie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:01
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量，就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下，多挑几个单克隆，用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话，一般延长酶切时间（最长可以过夜：12-16小时）就好了（之前需要上FastDigest的网站查询一下，看看所用的酶能够保持活性的时间是否足够长）。
赞一下 回复此楼
己欲立而立人，己欲达而达人。
4楼2015-05-03 23:49:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

auwdh

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:05
参照那个酶的使用说明书来做最把稳了。还有可以适当延长酶切时间或者酶量。有点切不干净没事的，不影响后续回收或者链接就行了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
我交出一片心，不怕你误解，谁没受过伤，谁没流过泪？
5楼2015-05-04 00:32:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-03 22:17:20
这很明显是质粒放多了，少放点质粒就OK了

质粒浓度一般不超过1微克，我这个总共也只有800ng，应该不多吧
赞一下 回复此楼
天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
6楼2015-05-04 08:45:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yan_nie at 2015-05-03 23:49:05
有一点点载体没切干净其实问题不大。如果连接产物转化后菌落数量远大于空载对照菌落数量，就暗示大部分菌落所含质粒是阳性产物。在这种情况下，多挑几个单克隆，用酶切或PCR选阳性克隆就好。
如果要切得更干净的话 ...

fast digest 这个你用的多不，说明书上说的是5-15分钟即可，我切的是30分钟，之前有酶切过夜，不过酶切后貌似载体有杂带出现，也就是可能伴随有切到其他位点的情况，这个问题你碰到过么
赞一下 回复此楼
天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
7楼2015-05-04 08:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 08:45:25
质粒浓度一般不超过1微克，我这个总共也只有800ng，应该不多吧...

实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
8楼2015-05-04 10:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-04 10:18:52
实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率
...

做连接 的话，你一般大概用多少纳克载体，多少纳克片段呀，我这个载体大概10K，片段0.7k和0.9k
赞一下 回复此楼
天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
9楼2015-05-04 12:27:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 再闹不给糖 at 2015-05-04 12:27:19
做连接 的话，你一般大概用多少纳克载体，多少纳克片段呀，我这个载体大概10K，片段0.7k和0.9k...

我不测浓度的，你可以切个梯度，尽量少切

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2015-05-04 12:28:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 再闹不给糖 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 PbwVEMK5haaE 2026-08-25 4/200 2026-08-26 03:20 by cNXvBfCpiZOM
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 Qj98d49dHFb9 2026-08-25 4/200 2026-08-26 03:08 by cNXvBfCpiZOM
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 7K1CJE38xLG4 2026-08-25 4/200 2026-08-26 02:04 by cNXvBfCpiZOM
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 19/950 2026-08-25 17:57 by chick875
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +20 羊腰板 2026-08-21 23/1150 2026-08-25 16:34 by zsna
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +7 炎黄贵胄 2026-08-22 8/400 2026-08-25 08:48 by ZJTJZ
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +25 yaoyewhu2008 2026-08-20 27/1350 2026-08-25 08:01 by Equinoxhua
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭