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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RT-PCR扩增2.6kb的片段，求更好方法！谢谢！
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR扩增2.6kb的片段，求更好方法！谢谢！ 已有3人参与

RT-PCR扩增2.6kb的片段，多次尝试没有扩增出全长，求更好方法，包括好的RT试剂盒推荐！
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1楼 2015-04-28 21:43:57
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wanglele87

金虫 (著名写手)
加点DMSO或者甜菜碱

[ 发自小木虫客户端 ]
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一生不羁放纵爱自由
2楼2015-04-28 21:55:50
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
半定量还是荧光定量？
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3楼2015-04-28 21:56:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
czcpudai: 金币+2 2015-04-29 20:36:12
运用重组PCR，绕过RT-PCR.
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4楼2015-04-28 23:22:20
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
czcpudai(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:50:27
czcpudai: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-04-29 20:35:16
你用cdna为模板你扩增这个片段，2.6kb有点大。建议你可以考虑一下多重PCR，设置几个温度，在一个总反应中设置不同的TM值来扩增。RACE的试剂盒里面就是这个原理。
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5楼2015-04-28 23:44:25
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-28 23:44:25
你用cdna为模板你扩增这个片段，2.6kb有点大。建议你可以考虑一下多重PCR，设置几个温度，在一个总反应中设置不同的TM值来扩增。RACE的试剂盒里面就是这个原理。

是以cDNA为模板来扩增，本来打算将其split into 4段，每段就680bp，再overlap拼接起来，但是，现在连680的bp都没扩出来，RNA是从真菌中提取的，RNA冻融过一次，之前质量还挺好
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6楼2015-04-29 20:35:06
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2015-04-28 23:22:20
运用重组PCR，绕过RT-PCR.

重组pcr如何理解？这段基因的内含子太多
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7楼2015-04-29 20:36:06
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

多少个内含子？2段一组装，或者多段同时组装。你自己看下over-lap PCR原理，很简单的。希望好运。
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8楼2015-04-29 21:01:28
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