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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR扩增2.6kb的片段,求更好方法!谢谢! 已有3人参与

RT-PCR扩增2.6kb的片段,多次尝试没有扩增出全长,求更好方法,包括好的RT试剂盒推荐!
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wanglele87

金虫 (著名写手)

加点DMSO或者甜菜碱

[ 发自小木虫客户端 ]
一生不羁放纵爱自由
2楼2015-04-28 21:55:50
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
半定量还是荧光定量?
3楼2015-04-28 21:56:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
czcpudai: 金币+2 2015-04-29 20:36:12
运用重组PCR,绕过RT-PCR.
4楼2015-04-28 23:22:20
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
czcpudai(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:50:27
czcpudai: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-04-29 20:35:16
你用cdna为模板你扩增这个片段,2.6kb有点大。建议你可以考虑一下多重PCR,设置几个温度,在一个总反应中设置不同的TM值来扩增。RACE的试剂盒里面就是这个原理。
5楼2015-04-28 23:44:25
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-28 23:44:25
你用cdna为模板你扩增这个片段,2.6kb有点大。建议你可以考虑一下多重PCR,设置几个温度,在一个总反应中设置不同的TM值来扩增。RACE的试剂盒里面就是这个原理。

是以cDNA为模板来扩增,本来打算将其split into 4段,每段就680bp,再overlap拼接起来,但是,现在连680的bp都没扩出来,RNA是从真菌中提取的,RNA冻融过一次,之前质量还挺好
6楼2015-04-29 20:35:06
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2015-04-28 23:22:20
运用重组PCR,绕过RT-PCR.

重组pcr如何理解?这段基因的内含子太多
7楼2015-04-29 20:36:06
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

多少个内含子?2段一组装,或者多段同时组装。你自己看下over-lap PCR原理,很简单的。希望好运。
8楼2015-04-29 21:01:28
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