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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 质粒抽提
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zy-2014

木虫 (小有名气)

[求助] 质粒抽提 已有1人参与

各位师兄师姐，你们好！
    我接的前人师兄的课题，菌（DH5α）已经保存了将近3年了，一直保存在-80℃里，中途为未活化过，现在我活化了，在50ug/ml的Ampr上4天以后长出了一堆菌，观察其菌落形态，应该是细菌，我就划单菌落了，始终没有长出单菌落，我没办法，只好把这一堆菌接种于1ml的种子培养液中培养了24h，见离心管中LB培养基浑浊以后，再将其接种于50ml的LB中培养36h，然后用Promege的10T质粒提取试剂盒抽取质粒，但电泳检测以后，没有条带，只有一条类似于瀑布状的散带，点样孔还亮着，好像是蛋白质污染了，总之是没有提出来质粒。我是分子生物学的小喽喽，希望各位大神能够帮我分析分析，给出您们的意见和建议，谢谢您们！
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1楼 2015-04-21 16:15:18
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feng37ye

新虫 (初入文坛)
没有见到电泳图，单看描述推断，有可能提出质粒了，不过拖尾严重，蛋白等杂志未去除干净。建议看一下solusion I 和 II 是否失效，还有操作非常重要，时间也要掌握好。能养出单菌落最好还是从单菌落阔培

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-04-21 16:54:28
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zy-2014: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢您，希望我有难题了你还是可以给我解惑，真心谢谢您…… 2015-04-23 15:38:10
首先，培养那么长时间，抗性早已失效，无法保证是不是杂菌，其次，大肠一般培养12小时应该就会长好，除非是质粒的问题。
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3楼2015-04-21 20:34:22
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zy-2014

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feng37ye at 2015-04-21 16:54:28
没有见到电泳图，单看描述推断，有可能提出质粒了，不过拖尾严重，蛋白等杂志未去除干净。建议看一下solusion I 和 II 是否失效，还有操作非常重要，时间也要掌握好。能养出单菌落最好还是从单菌落阔培
...

谢谢您……
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4楼2015-04-23 15:18:12
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zy-2014

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浅语8905 at 2015-04-21 20:34:22
首先，培养那么长时间，抗性早已失效，无法保证是不是杂菌，其次，大肠一般培养12小时应该就会长好，除非是质粒的问题。

谢谢您……您觉得我的下一步应该怎么做呢？的确我的菌就长了快四天才长出来的……谢谢您……
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5楼2015-04-23 15:19:57
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zy-2014

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feng37ye at 2015-04-21 16:54:28
没有见到电泳图，单看描述推断，有可能提出质粒了，不过拖尾严重，蛋白等杂志未去除干净。建议看一下solusion I 和 II 是否失效，还有操作非常重要，时间也要掌握好。能养出单菌落最好还是从单菌落阔培
...

谢谢您……
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6楼2015-04-23 15:23:19
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zy-2014

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feng37ye at 2015-04-21 16:54:28
没有见到电泳图，单看描述推断，有可能提出质粒了，不过拖尾严重，蛋白等杂志未去除干净。建议看一下solusion I 和 II 是否失效，还有操作非常重要，时间也要掌握好。能养出单菌落最好还是从单菌落阔培
...

我的菌长了四天才出来，我划单菌落了，但是在有氨苄抗性的培养基上没有长出单菌落，只是在开始划的哪儿有一堆，其它地方就没长，很惆怅，我自己在显微观察，不是杆状，是球状，哎，真心谢谢您……
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7楼2015-04-23 15:26:18
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zy-2014 at 2015-04-23 15:19:57
谢谢您……您觉得我的下一步应该怎么做呢？的确我的菌就长了快四天才长出来的……谢谢您……...

先接在LB液体培养基中试试，看看长不长，如果长的话就可以划线看看
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8楼2015-04-23 17:43:41
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zy-2014

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 浅语8905 at 2015-04-23 17:43:41
先接在LB液体培养基中试试，看看长不长，如果长的话就可以划线看看...

LB中加不加抗性，加上抗性……？谢谢您。
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9楼2015-04-23 17:50:00
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zy-2014 at 2015-04-23 17:50:00
LB中加不加抗性，加上抗性……？谢谢您。...

可以试试梯度，另外，注意一下你的质粒有没有需要注意的地方，比如培养温度之类
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10楼2015-04-23 19:44:41
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