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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 最近在做crispr，请问大家能否告知sgRNA怎么合成还是转录得到
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我是丫丫

木虫 (正式写手)

[求助] 最近在做crispr，请问大家能否告知sgRNA怎么合成还是转录得到 已有4人参与

请问大家能否告知sgRNA怎么合成还是转录得到，另外在原核生物中能做吗？特异性序列多长？还有CRISPR-Cas9表达载体是买的还是自己构建的？刚接触这个课题，不懂，求大神讲解
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
1楼 2015-04-14 09:56:10
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maiduo

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你cre loxp不做了？

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2楼2015-04-14 14:06:30
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我是丫丫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by maiduo at 2015-04-14 14:06:30
你cre loxp不做了？

？？
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
3楼2015-04-14 18:48:46
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shenma521

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我是丫丫(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:41:51
sgRNA 是可以在合成引物的公司合成单链带上酶切位点，通过随机退火制备成带酶切位点的小片段再连接到载体上，然后再买一个相关的cas9质粒就可以了。

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-04-14 21:46:00
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我是丫丫: 金币+1 2015-04-22 15:00:37
酶切位点+20bp长度，原核可以做，不知道你做的是什么菌，要看看转化效率
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5楼2015-04-15 13:31:43
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我是丫丫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pypsak at 2015-04-15 13:31:43
酶切位点+20bp长度，原核可以做，不知道你做的是什么菌，要看看转化效率

原核生物，你们的sgRNA怎么得到的？转录得到还是通过质粒进行p出来？
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
6楼2015-04-22 15:00:27
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yzheng29

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

sgRNA是送出去合成得到的。
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7楼2015-04-22 18:01:31
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
我是丫丫: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-04-24 09:58:29
引用回帖:
6楼: Originally posted by 我是丫丫 at 2015-04-22 15:00:27
原核生物，你们的sgRNA怎么得到的？转录得到还是通过质粒进行p出来？...

有两种方法：1，体外转录sgRNA+ tracrRNA，然后跟cas9蛋白同转化细菌；2，是构建适合你得菌的敲除质粒，主要是启动子这块需要考虑，但是质粒进去了你得考虑到质粒会一直存在细菌中。
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8楼2015-04-23 08:56:48
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我是丫丫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pypsak at 2015-04-23 08:56:48
有两种方法：1，体外转录sgRNA+ tracrRNA，然后跟cas9蛋白同转化细菌；2，是构建适合你得菌的敲除质粒，主要是启动子这块需要考虑，但是质粒进去了你得考虑到质粒会一直存在细菌中。...

traceRNA的这个序列怎么得到？sgRNA的20bp可以根据目标序列得到，那traceRNA呢，求解答
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
9楼2015-04-24 09:58:19
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我是丫丫

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pypsak at 2015-04-23 08:56:48
有两种方法：1，体外转录sgRNA+ tracrRNA，然后跟cas9蛋白同转化细菌；2，是构建适合你得菌的敲除质粒，主要是启动子这块需要考虑，但是质粒进去了你得考虑到质粒会一直存在细菌中。...

还有我目前设计的就是打算用第一种方法。多谢
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
10楼2015-04-24 09:59:10
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