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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xinniya

金虫 (小有名气)

[交流] 求助:2871bp的片段扩出来很多杂带,怎么回事?

我用E-Taq酶扩增长为2871bp的片段,引物是特异引物,长度为18bp,Tm值是54。条件是,25微升的体系,酶0.2微升;dNTP2微升,模板和引物均为1微升;94度5min----94度50sec-----54度50sec-------72度1min45sec-----72度10min;温度梯度上下浮动5度。
结果扩出来的带有很多小于2800的杂带,目的带很不清晰。这是怎么回事?是因为引物太短还是延伸的时间不够?还是酶不合适?
多谢了!
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yuyixst

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
那扩增产物再次扩增哦,也许会好
2楼2008-07-01 10:51:29
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yuyixst

木虫 (正式写手)

reasonspare(金币+0,VIP+0):楼主还有问题,你再看看。
感觉是不是你的延伸时间有点短?
3楼2008-07-01 10:52:59
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静水深流106

铁虫 (初入文坛)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
可以提高你的退火温度,减少模板浓度,减少循环数看下
4楼2008-07-01 11:21:04
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):楼主还有问题,你再看看。
嗯,同意二楼的说法,一般来说最可以保证的是1K/s,所以长度比较大,延伸有些短了
还有就是那么长一般出现错配比较多
你的引物长度也一般,我们至少都要二十一个配对的
还有就是你引物可能有同源性,建议比下序列,换个引物试试
5楼2008-07-01 11:28:45
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xinniya

金虫 (小有名气)

我换了个专门扩增长链的试试,你们说可行否?
6楼2008-07-24 10:11:56
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

引用回帖:
Originally posted by xinniya at 2008-7-24 10:11:
我换了个专门扩增长链的试试,你们说可行否?

可以试下!

出现杂带的原因很多:

1、引物特异性不高,产生了非特异性结合;
2、退火温度过低,使引物菲特异性结合;
3、体系污染。

我感觉你可以提高下退火温度,延长延伸时间(1K/S),模板量减少!
7楼2008-07-24 16:33:11
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xinniya

金虫 (小有名气)

好的,谢谢
8楼2008-07-29 08:17:19
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liuyan6817

还有个办法,将目的片段回收,做模板进行扩增
9楼2008-07-29 09:03:30
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lyzwj1118

木虫 (小有名气)

先说一下扩增的是东西啊,cDNA,还是基因组,具体是做的什么东西,大家才好帮你分析
10楼2008-07-29 10:19:32
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