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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：2871bp的片段扩出来很多杂带，怎么回事？
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xinniya

金虫 (小有名气)

[交流] 求助：2871bp的片段扩出来很多杂带，怎么回事？

我用E-Taq酶扩增长为2871bp的片段，引物是特异引物，长度为18bp，Tm值是54。条件是，25微升的体系，酶0.2微升；dNTP2微升，模板和引物均为1微升；94度5min----94度50sec-----54度50sec-------72度1min45sec-----72度10min；温度梯度上下浮动5度。
结果扩出来的带有很多小于2800的杂带，目的带很不清晰。这是怎么回事？是因为引物太短还是延伸的时间不够？还是酶不合适？
多谢了！
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1楼 2008-07-01 10:29:18
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yuyixst

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
那扩增产物再次扩增哦，也许会好
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2楼2008-07-01 10:51:29
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yuyixst

木虫 (正式写手)
reasonspare(金币+0,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
感觉是不是你的延伸时间有点短？
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3楼2008-07-01 10:52:59
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静水深流106

铁虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
可以提高你的退火温度,减少模板浓度,减少循环数看下
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4楼2008-07-01 11:21:04
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
嗯,同意二楼的说法,一般来说最可以保证的是1K/s,所以长度比较大,延伸有些短了
还有就是那么长一般出现错配比较多
你的引物长度也一般,我们至少都要二十一个配对的
还有就是你引物可能有同源性,建议比下序列,换个引物试试
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5楼2008-07-01 11:28:45
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xinniya

金虫 (小有名气)
我换了个专门扩增长链的试试，你们说可行否？
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6楼2008-07-24 10:11:56
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
Originally posted by xinniya at 2008-7-24 10:11:
我换了个专门扩增长链的试试，你们说可行否？

可以试下！

出现杂带的原因很多：

1、引物特异性不高，产生了非特异性结合;
2、退火温度过低，使引物菲特异性结合；
3、体系污染。

我感觉你可以提高下退火温度，延长延伸时间（1K/S），模板量减少！
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7楼2008-07-24 16:33:11
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xinniya

金虫 (小有名气)
好的，谢谢
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8楼2008-07-29 08:17:19
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liuyan6817

还有个办法，将目的片段回收，做模板进行扩增
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9楼2008-07-29 09:03:30
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lyzwj1118

木虫 (小有名气)
先说一下扩增的是东西啊，cDNA，还是基因组，具体是做的什么东西，大家才好帮你分析
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10楼2008-07-29 10:19:32
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