24小时热门版块排行榜    

查看: 683  |  回复: 11
当前主题已经存档。

xinniya

金虫 (小有名气)

[交流] 求助:2871bp的片段扩出来很多杂带,怎么回事?

我用E-Taq酶扩增长为2871bp的片段,引物是特异引物,长度为18bp,Tm值是54。条件是,25微升的体系,酶0.2微升;dNTP2微升,模板和引物均为1微升;94度5min----94度50sec-----54度50sec-------72度1min45sec-----72度10min;温度梯度上下浮动5度。
结果扩出来的带有很多小于2800的杂带,目的带很不清晰。这是怎么回事?是因为引物太短还是延伸的时间不够?还是酶不合适?
多谢了!
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuyixst

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
那扩增产物再次扩增哦,也许会好
2楼2008-07-01 10:51:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuyixst

木虫 (正式写手)

reasonspare(金币+0,VIP+0):楼主还有问题,你再看看。
感觉是不是你的延伸时间有点短?
3楼2008-07-01 10:52:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

静水深流106

铁虫 (初入文坛)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
可以提高你的退火温度,减少模板浓度,减少循环数看下
4楼2008-07-01 11:21:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轻5飞扬

金虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):楼主还有问题,你再看看。
嗯,同意二楼的说法,一般来说最可以保证的是1K/s,所以长度比较大,延伸有些短了
还有就是那么长一般出现错配比较多
你的引物长度也一般,我们至少都要二十一个配对的
还有就是你引物可能有同源性,建议比下序列,换个引物试试
5楼2008-07-01 11:28:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinniya

金虫 (小有名气)

我换了个专门扩增长链的试试,你们说可行否?
6楼2008-07-24 10:11:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

引用回帖:
Originally posted by xinniya at 2008-7-24 10:11:
我换了个专门扩增长链的试试,你们说可行否?

可以试下!

出现杂带的原因很多:

1、引物特异性不高,产生了非特异性结合;
2、退火温度过低,使引物菲特异性结合;
3、体系污染。

我感觉你可以提高下退火温度,延长延伸时间(1K/S),模板量减少!
7楼2008-07-24 16:33:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinniya

金虫 (小有名气)

好的,谢谢
8楼2008-07-29 08:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuyan6817

还有个办法,将目的片段回收,做模板进行扩增
9楼2008-07-29 09:03:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyzwj1118

木虫 (小有名气)

先说一下扩增的是东西啊,cDNA,还是基因组,具体是做的什么东西,大家才好帮你分析
10楼2008-07-29 10:19:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xinniya 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见