[求助] crispr/cas9 敲除细菌基因的实验步骤已有1人参与

我想用crispr/cas9系统敲除或失活大肠杆菌中的一些基因。我现在又pCRISPR和pCAS9两个质粒。
但是我不知道具体的试验方法。或者大体的步骤也行。
请各位不吝赐教。

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1楼2015-03-16 14:51:35

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

yili_90

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yangbin1: 金币+5, ★有帮助 2015-03-28 09:34:28
yangbin1: 金币+5 2015-06-05 16:59:30

1.设计基因切除位点（就是设计sgRNA)。可以利用Crispr.mit在线设计，也可以手动设计后在NCBI进行blast。
2.将设计好的”sgRNA+限制性酶切位点“送到测序公司进行合成
3.用限制性内切酶切割载体
4.连接，转化，鉴定，测序
5.将对的扩增后进行体外转录
*如果是动物，则进行胚胎注射。如果是细胞，可以进行电转。如果是细菌，我估计是转化
6.细胞和细菌会要求载体上有筛选标记，如puro。动物不要求。

哎，其实我也不太清楚。不过前期大致应该就是这样。因为最近我在动物身上做crispr/cas9