| 查看: 3387 | 回复: 19 | ||
[交流]
中科院李劲松实验室在Cell Stem Cell发文章揭示CRISPR/Cas9存在脱靶效应 已有19人参与
|
|
中科院生化细胞所李劲松实验室利用CRISPR/Cas9技术对引起小鼠白内障遗传疾病的Crygc基因进行了研究，打靶的小鼠可以通过生殖细胞将修复的Crygc基因传递到下一代，因此由CRISPR/Cas9技术介导的遗传疾病治疗研究为人类基因治疗提供了一条新的思路。但是，李劲松实验室发现CRISPR/Cas9有严重脱靶现象，分别表现在以下两个方面：一方面，在Crygc突变位置(与野生型基因相比，缺失一个碱基)共设计5条sgRNA并打靶发现，有2条sgRNA可以有效地切割野生型位点，显示CRISPR/Cas9在此处有40%的脱靶率；另一方面，研究人员为了检测脱靶另做了120个PCR和测序发现，确实有脱靶位点被切割，而且其中之一的脱靶位点是在核心序列只有11bp与基因组位置配对的情况下仍然被切割成功，此脱靶现象的存在使得CRISPR/Cas9在临床应用上可能存在无法避免的安全隐患，同时使得基础研究引入很多不确定性，所以CRISPR/Cas9在临床应用和科学研究中受到很大局限。 CRISPR/Cas9的切割是通过向导RNA（sgRNA）与基因组位点之间20bp碱基的配对，再引导Cas9实现的，但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于sgRNA与靠近PAM(NGG)处10-12bp碱基的配对，其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响较小，而我们知道，要想在一个基因组中产生特异性位点至少需要16个碱基的配对才可实现特异。同时文献中报道Cas9也可以识别NAG附近的序列并进行打靶，这些研究说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这些问题严重地限制了CRISPR/Cas9的应用。 目前最常用的基因修饰技术有TALEN和CRISPR/Cas9两种。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸内切酶组成，利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化组合蛋白，从而达到识别内源性基因的目的。CRISPR/Cas9是由CRISPR相关基因和Cas9基因组成，Cas9会在sgRNA的指引下，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，同时CRISPR/Cas9的切割也依赖于sgRNA和基因组特定位点配对区5′端的PAM结构，使得sgRNA设计变得复杂。过去有些研究者尽管知道CRISPR/Cas9的脱靶严重，但是由于构建TALEN质粒步骤的繁琐使得他们还在TALEN和CRISPR/Cas9技术中徘徊，而现在FastTALE技术的出现使得TALEN质粒的构建可以很容易地在1天内完成，从而更能方便研究人员对TALEN技术的使用。 |
回复此楼
 |
2楼2014-01-09 13:51:10
kaixinla168
银虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 502.2
- 散金: 10
- 红花: 1
- 帖子: 336
- 在线: 36.3小时
- 虫号: 2869771
- 注册: 2013-12-13
- 性别: GG
- 专业: 信号理论与信号处理
3楼2014-01-09 19:07:48
| ！！ |
4楼2014-01-10 23:54:56
lukecana
至尊木虫 (著名写手)
头衔待定
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 17916.8
- 红花: 74
- 帖子: 2279
- 在线: 498.3小时
- 虫号: 667753
- 注册: 2008-12-04
- 性别: GG
- 专业: 有机高分子功能材料
5楼2014-01-11 02:21:05
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
6楼2014-01-13 13:15:40
Coolly
金虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1106.9
- 散金: 6190
- 红花: 11
- 帖子: 769
- 在线: 405.2小时
- 虫号: 2420702
- 注册: 2013-04-16
- 专业: 细胞信号转导
7楼2014-01-13 13:44:13
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2014-01-13 15:01:35
|
本帖内容被屏蔽 |
9楼2014-01-13 15:41:00
10楼2014-07-09 10:45:38
