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yangbin1金虫 (正式写手)
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[求助]
crispr/cas9 敲除细菌基因的实验步骤已有1人参与
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我想用crispr/cas9系统 敲除或失活大肠杆菌中的一些基因。我现在又pCRISPR和pCAS9两个质粒。 但是我不知道具体的试验方法。或者大体的步骤也行。 请各位不吝赐教。 |
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2楼2015-03-24 10:30:38
yili_90
金虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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yangbin1: 金币+5, ★有帮助 2015-03-28 09:34:28
yangbin1: 金币+5 2015-06-05 16:59:30
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yangbin1: 金币+5 2015-06-05 16:59:30
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1.设计基因切除位点（就是设计sgRNA)。可以利用Crispr.mit在线设计，也可以手动设计后在NCBI进行blast。 2.将设计好的”sgRNA+限制性酶切位点“送到测序公司进行合成 3.用限制性内切酶切割载体 4.连接，转化，鉴定，测序 5.将对的扩增后进行体外转录 *如果是动物，则进行胚胎注射。如果是细胞，可以进行电转。如果是细菌，我估计是转化 6.细胞和细菌会要求载体上有筛选标记，如puro。动物不要求。 哎，其实我也不太清楚。不过前期大致应该就是这样。因为最近我在动物身上做crispr/cas9 |
3楼2015-03-24 13:04:10