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CRISPR/Cas9 开启基因定点修饰的新篇章!
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“因为它独特基因组编辑能力，CRISPR技术引起了越来越多的科学家关注，它能够修复有缺陷的基因，或使残缺变得更美好”，NPR（National Public Radio，即美国国家公共电台）近日盛赞了CRISPR技术会基因界带来的变化。 “真的很强大，这是一个非常激动人心的发展，因为现在你可以从本质上改变基因组将几乎任何你想要的（Now you can essentially change a genomeat will to almost anything you want. The sky's the limit）”作为2006年的诺贝尔奖获得者，马萨诸塞大学医学院（Massachusetts Medical School）的Craig Mello对记者如是说。 Craig Mello表示：CRISPR技术离医学不远了，正在朝着转化医学的方向前进，因此他创办了一家名叫“CRISPR Therapeutics”的公司，开发一些遗传性血液疾病如镰状细胞性贫血、地中海贫血等的诊断疗法。 他还表示：从理论上讲“可通过移除病人的骨髓，先修复受损基因，然后返回修复细胞的病人来治疗遗传性疾病”是可行的； 然而在过去实践中成功的方法几乎是不可能的。 但是现在，通过利用患者自身的细胞进行的诊断疗法已经使成本不断下降，基本上具备采用该种手段来治疗遗传学疾病。 “为了安全性起见，将CRISPR技术用于治疗病人仍然需要很多测试”，尽管医生们已经很看好该技术在转化医学上的应用前景，但科学家貌似并没有对这项技术的实际应用投入足够的热情。就目前而言，科学家还未试图采用CRISPR技术治愈疾病，他们仅仅是想通过技术探索自然界中生物的一些基本属性，主要还是停留在基础科学研究方面。 但是，现在非常看好CRISPR技术的不只Craig Mello。加州大学伯克利分校（University of California，Berkeley ）的Jennifer Doudna通过研究“细菌如何对抗流感”，发现细菌比人类更不容易感染流感病毒。 “细菌对抗流感病毒”的方式使Doudna和她的团队产生这样的想法：“细菌有特殊的酶，可以切开入侵病毒的DNA和改变DNA的碱基，本质上杀死病毒。” Doudna说：如果这种机制能够在动物或植物细胞中起作用，采用CRISPR技术进行基因编辑将会是是一个非常有用且强大的工具。它能将我们希望表达的任意小小片段插入到相应的位点，除了那些感染细菌的病毒的DNA序列，还可以定向改造任何DNA序列修饰酶表达。 如Craig Mello一样，Doudna也看到了CRISPR技术在医学上的应用前景，于是乎也和别人合伙创造了一家叫做“Editas Medicine”的生物科技公司，希望使用这项技术来开发新疗法。 NPR的Joe Palca说，“尽管医生说CRISPR技术要安全的应用于医学仍需很多测试，试问那些还没有热衷于转化医学应用的科学家是否也看到了它的各种可能性？” |
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2楼2014-08-15 17:41:30
3楼2014-08-15 17:49:55
niushuaiji
金虫 (正式写手)
不放弃的小鸟
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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| 最近发表于Genome Res上的文章，已有人取地中海贫血症患者体细胞，采用CRISPR-Cas9 DNAediting技术将上述患者体细胞中突变位点予以修正。链接如下http://genome.cshlp.org/content/early/2014/07/30/gr.173427.114 |
4楼2014-08-16 09:34:03
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5楼2014-09-04 08:20:55
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6楼2015-07-15 10:47:41
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7楼2015-07-16 11:21:41
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8楼2015-08-14 20:45:53
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CRISPR/Cas9基因敲除阳性单克隆筛选： 可以采用有限稀释法筛选单克隆（如果您的敲除载体有puro等抗性，需要将电转后的细胞药杀后再有限稀释筛选单克隆），具体步骤如下： 1.将电转后pool细胞有限稀释至96孔板中，待3-4个星期后，单克隆细胞生长至足量，使用Genloci TNA抽提试剂盒提取基因组（针对微量样品，少到500个细胞的基因组提取）； 2.PCR敲除位点附近序列（可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物）、Cruiser™基因敲除检测试剂盒筛选阳性克隆（错配酶酶切跑电泳方法）； 3.对第2步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况。 最后筛出我们想要的单克隆。 |
9楼2015-08-17 10:34:15
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Cruiser™酶，它是一种具天然强活性的核酸内切酶，与CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点，并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA，不会出现假阳性。 实验流程： 1. 基因组DNA的准备：提取野生型和突变型细胞的基因组DNA（或者混合克隆的基因组）。Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒也能帮您的忙，只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA。 2. 杂交DNA的准备： a) PCR引物设计：一般扩增产物长度为300~600 bp  b) PCR扩增：获得杂交DNA 3. Cruiser™酶筛选阳性克隆：无需纯化DNA，直接使用PCR产物，混合体系后45℃下反应15~20 min  K562细胞中Atg10基因敲除案例 M：100 bp-DNA Marker；pool：混合克隆；clone1-18：单克隆；positive：Positive Control DNA 结论：pool（混合克隆）的结果显示，基因敲除的效率约为40%。clone3, 7, 8, 11, 15和17为潜在的阳性克隆，后续直接进行TA克隆进行验证等位基因突变情况。 |
10楼2015-08-17 10:38:02