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silviasj

金虫 (著名写手)

[交流] 求助转化问题

目的基因用HindIII和BamHI双切后，与HindIII和BamHI双切后的pWB980连接后转化枯草芽孢杆菌DB104，转化子验证，HindIII单切后，不到500bp处和3700bp处有两条带；BamHI单切后，4200bp处有一条带；HindIII和BamHI双切后，不到500bp处和3700bp处有两条带。请高人指教这是怎么回事？

[ Last edited by silviasj on 2008-6-13 at 21:34 ]
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1楼 2008-06-13 21:17:32
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superwheat

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+10,VIP+0):代谢
reasonspare(金币+0,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
其实我觉得直接去测个序比较方便，有了序列什么都好分析
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2楼2008-06-14 01:45:11
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sevenlight967

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+10,VIP+0):代谢
reasonspare(金币+0,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
似乎你目的基因里面有个HINDIII的位点啊。

一开始克隆到载体前目的基因你可能切的不完全，所以这个位点在后面暴露出来了。
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3楼2008-06-14 05:21:06
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silviasj

金虫 (著名写手)
谢谢各位虫友，我会去测个序并分析一下的~！
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4楼2008-06-14 10:47:27
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silviasj

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sevenlight967 at 2008-6-14 05:21:
似乎你目的基因里面有个HINDIII的位点啊。

一开始克隆到载体前目的基因你可能切的不完全，所以这个位点在后面暴露出来了。

可是我的目的基因里要是有HINDIII的话，我双酶切后应该有两个片段，一个带有HIND的双位点，一个带有BAM和HIND的双位点，而我的载体是被HIND和BAM双切的，只会连接有HIND和BAM的双位点的目的基因，这时候用HIND单切的话不会有500的那条带啊，只会和BAM单切时一样在4200处有带，对吗？
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5楼2008-06-14 11:04:32
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reasonspare

木虫 (著名写手)
不是很清楚，但是楼主能不能这么想

  -BamHI--------------HindIII------------------------------------------BamHI- HindIII----

如果BamHI位于基因的两端 大约4200，所以用BamHI 产物4200
如果一端的BamHI和HindIII为点接近 50-100bp假设，单切 就是 500 和3700
双切还是 500+3700=4200
当然也可能是瞎说，还是以序列为准。
仅供参考
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大慈大悲观世音救苦救难观世音有求必应观世音普渡众生观世音千手千眼观世音官大敢管观世音无处不在观世音普观普长观世音南无观世音菩萨
6楼2008-06-14 11:24:50
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superwheat

银虫 (正式写手)
你的载体和目标片断分别多长？
到别的试验室借个酶试试看会不会酶被污染了
此外，其实测个序，对的错的就一目了然了
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7楼2008-06-14 11:26:27
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silviasj

金虫 (著名写手)
我的载体3700，目的片段1600，酶绝对没问题，全是新的。
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8楼2008-06-14 11:36:17
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superwheat

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silviasj(金币+10,VIP+0):谢谢~！
那就是说单酶切4200bp其实也并不符合你的要求咯。
还少了1100bp的一大段
那我觉得目标基因中间还可能有不止一个HindIII/BamHI的位点。
当初你设计引物的时候有没有考虑过限制性酶的选择？

通常内切酶对引物上的酶切位点效率比较低，而片断中间的酶切位点活性比较高
所以我觉得即使酶切不完全，也是有限把中间的位点切掉了。
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9楼2008-06-14 14:18:42
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silviasj

金虫 (著名写手)
回楼上的，首先谢谢你的关注与回答，其实这个基因已经有前面的师兄连接到了穿梭载体上，只是表达量不够，所以希望能连在980上直接转进枯草当中去提高表达量，前面师兄构建的时候也是这两个酶切位点，一样的基因，已经成功构建，所以说如果基因上有这些酶切位点，他也不能构建成功是吧？你说呢？
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10楼2008-06-14 14:41:16
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