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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pfu酶使用
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shengchen

铜虫 (初入文坛)

[求助] pfu酶使用 已有4人参与

请教各位一个问题，本人用一对引物从基因组上扩增片断，同等条件下用taq能扩出，pfu怎么也扩不出；当我用另一对引物从质粒上扩增时，同样的情况也出现了。。。并且经过测序，发现用taq扩出的目的片段都是对的，为什么pfu酶怎么也扩不出来，求教各位高手，谢谢！
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凡人皆有一死，凡人必须侍奉
1楼 2015-02-12 23:10:19
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shengchen: 金币+1 2015-02-13 21:44:09
体系不对，buffer不对？酶失活？排除过了吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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有时一本正经，有时胡言乱语。
2楼2015-02-12 23:47:55
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shengchen: 金币+1 2015-02-13 21:44:20
pfu活性不如taq,试下提高模板浓度
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2015-02-13 02:25:13
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shengchen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-13 20:56:01
这是经常的事，同样的引物用不同的酶来扩增，有的可以扩出来，有的扩不出来。在用酶试的时候最好按照说明书上的比例来试。我经常遇到这种问题用一种酶怎么也扩不出来，换一种酶就OK了。试着换一下退火温度，变性时间等。
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4楼2015-02-13 12:32:06
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shengchen(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-02-13 20:56:12
呵呵，pfu的概念是高保真酶，那它为什么会有保真性呢，因为它能将错配的碱基切除，从而保真扩增中片段的正确性，所以它能切掉错误的碱基，所以它也可能将模板降解，导致扩增失败。所以，如果你的实验下游不需要进行精密实验的话，不建议使用保真酶。如果你担心普通的Taq酶扩增特异性差杂带较多的话，热启动Taq酶不是很好的选择吗，不会降解模板同时又能绝对的避免非特异性产物生成。
http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-02-13 17:06:32
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shengchen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-13 17:06:32
呵呵，pfu的概念是高保真酶，那它为什么会有保真性呢，因为它能将错配的碱基切除，从而保真扩增中片段的正确性，所以它能切掉错误的碱基，所以它也可能将模板降解，导致扩增失败。所以，如果你的实验下游不需要进行 ...

我之所以要用pfu是因为之前敲除基因就是用的taq，结果测序发现在上游基因中悲剧的出现了一个点突变使得我得重来就只能用pfu保证不会出现突变。。。
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凡人皆有一死，凡人必须侍奉
6楼2015-02-13 20:50:04
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shengchen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天地一微尘 at 2015-02-13 12:32:06
这是经常的事，同样的引物用不同的酶来扩增，有的可以扩出来，有的扩不出来。在用酶试的时候最好按照说明书上的比例来试。我经常遇到这种问题用一种酶怎么也扩不出来，换一种酶就OK了。试着换一下退火温度，变性时间 ...

换一种高保真酶？
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凡人皆有一死，凡人必须侍奉
7楼2015-02-13 20:53:17
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shengchen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-02-13 02:25:13
pfu活性不如taq,试下提高模板浓度

我得模板浓度是100ng/微升，应该不是模板浓度问题
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凡人皆有一死，凡人必须侍奉
8楼2015-02-13 20:54:41
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shengchen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by still2008 at 2015-02-12 23:47:55
体系不对，buffer不对？酶失活？排除过了吗？

排除过了，我扩过其他东西的没问题
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凡人皆有一死，凡人必须侍奉
9楼2015-02-13 20:55:33
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Forlornhope

新虫 (初入文坛)
pfu酶扩增效率太低了，可以taq酶和pfu酶适当比例混合使用效果会比较好

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10楼2015-02-14 07:31:51
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