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Western 杂交不出条带，求助 已有3人参与
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各位前辈及虫友帮帮忙，最近做western杂交不出来目的条带，想求助各位指教。具体情况如下： 因为我做的是植物叶绿体蛋白，目的是想看叶绿体蛋白的变化情况，所以提取类囊体蛋白，用的是Hepes缓冲液。提取出的类囊体测定叶绿素含量后液氮速冻保存。跑western时，先跑了SDS胶用考马斯亮蓝定量，每孔上样量以叶绿素含量来订，大概是10ug每孔，最后以这个上样量来做western杂交。其中转膜为过夜，且maker也明显转到PVDF膜上了。再封闭2h，一抗5h，TBS清洗2次，每次20min，在用二抗杂交2h，最后再TBS清洗2次，每次10min。再显色，其中一抗是PBS缓冲液配制的，二抗是TBS缓冲液配制的，最后显色是采用碱性磷酸酶和NBT/BCIP一起来显色的。但是做过两次，第二次上样量增加到15ug每孔的叶绿素，但是也都还是没有目的条带。其中考马斯亮蓝定量时，能看出目的条带位置处是有条带的。请问各位前辈知道是什么原因么？会不会是因为一抗二抗缓冲液不同导致的呢？还是说是因为一抗特异性不高（但是一抗是刚买回来，按说明书稀释保存的，-20°C保存大概半年）？请各位前辈帮帮忙，不胜感激！ |
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【答案】应助回帖
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1.可以增加上样量 2.一抗可以4°冰箱过夜，如果抗体效价不高可以增大一抗浓度或者延长一抗孵育时间 3.洗一抗时，不要过于激烈，可以TBST洗5次，每次5min 4.二抗浓度适当，室温孵育1h即可（确定二抗没问题，可以做个平行实验，或者实验室其他人用一下，看是否工作） 5.洗二抗同洗一抗 6.我一般是选择ELC显影，没用过碱性磷酸酶显色法，所以没有有用的意见提供~~ 封闭是用封闭液将PVDF膜没有结合蛋白的地方封闭上，减少背景，所以摇动要缓慢，提供充足的接触，也可以不要动，或者封闭过夜都可以。洗膜时摇动剧烈可能会将一抗洗掉，所以不要过于激烈。 祝实验顺利~~ |
4楼2015-02-08 13:57:26
mulongyan
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