| 查看: 1843 | 回复: 6 | ||
[求助]
Western 杂交不出条带，求助已有3人参与
|
|
各位前辈及虫友帮帮忙，最近做western杂交不出来目的条带，想求助各位指教。具体情况如下： 因为我做的是植物叶绿体蛋白，目的是想看叶绿体蛋白的变化情况，所以提取类囊体蛋白，用的是Hepes缓冲液。提取出的类囊体测定叶绿素含量后液氮速冻保存。跑western时，先跑了SDS胶用考马斯亮蓝定量，每孔上样量以叶绿素含量来订，大概是10ug每孔，最后以这个上样量来做western杂交。其中转膜为过夜，且maker也明显转到PVDF膜上了。再封闭2h，一抗5h，TBS清洗2次，每次20min，在用二抗杂交2h，最后再TBS清洗2次，每次10min。再显色，其中一抗是PBS缓冲液配制的，二抗是TBS缓冲液配制的，最后显色是采用碱性磷酸酶和NBT/BCIP一起来显色的。但是做过两次，第二次上样量增加到15ug每孔的叶绿素，但是也都还是没有目的条带。其中考马斯亮蓝定量时，能看出目的条带位置处是有条带的。请问各位前辈知道是什么原因么？会不会是因为一抗二抗缓冲液不同导致的呢？还是说是因为一抗特异性不高（但是一抗是刚买回来，按说明书稀释保存的，-20°C保存大概半年）？请各位前辈帮帮忙，不胜感激！ |
回复此楼» 猜你喜欢
请问有评职称，把科研教学业绩算分排序的高校吗
已经有6人回复
-
2025冷门绝学什么时候出结果
已经有6人回复
-
Bioresource Technology期刊，第一次返修的时候被退回好几次了
已经有7人回复
-
真诚求助：手里的省社科项目结项要求主持人一篇中文核心，有什么渠道能发核心吗
已经有8人回复
-
寻求一种能扛住强氧化性腐蚀性的容器密封件
已经有5人回复
-
请问哪里可以有青B申请的本子可以借鉴一下。
已经有4人回复
-
请问下大家为什么这个铃木偶联几乎不反应呢
已经有5人回复
-
天津工业大学郑柳春团队欢迎化学化工、高分子化学或有机合成方向的博士生和硕士生加入
已经有4人回复
-
康复大学泰山学者周祺惠团队招收博士研究生
已经有6人回复
-
AI论文写作工具：是科研加速器还是学术作弊器？
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
低表达量的蛋白SDS-PAGE检测不出来，该用什么方法检测？
已经有8人回复- 求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
已经有7人回复
- 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册及相关问题
已经有313人回复
- westen blot 染色
已经有11人回复
- 【求助/交流】southern blot 转膜
已经有10人回复
- 【求助/交流】western杂交
已经有16人回复
- 【求助/交流】糖蛋白染色方法
已经有7人回复
董博士
金虫 (正式写手)
- 应助: 155 (高中生)
- 金币: 3129.1
- 红花: 24
- 帖子: 312
- 在线: 96.2小时
- 虫号: 3524307
- 注册: 2014-11-07
- 专业: 医学图像数据处理与分析
2楼2015-02-08 07:53:33
3楼2015-02-08 12:41:38
504775490
金虫 (知名作家)
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 5689.2
- 散金: 1155
- 红花: 22
- 帖子: 9590
- 在线: 289.9小时
- 虫号: 1309424
- 注册: 2011-05-29
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
丫头小盆子(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-02-08 20:28:52
感谢参与，应助指数 +1
丫头小盆子(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-02-08 20:28:52
|
1.可以增加上样量 2.一抗可以4°冰箱过夜，如果抗体效价不高可以增大一抗浓度或者延长一抗孵育时间 3.洗一抗时，不要过于激烈，可以TBST洗5次，每次5min 4.二抗浓度适当，室温孵育1h即可（确定二抗没问题，可以做个平行实验，或者实验室其他人用一下，看是否工作） 5.洗二抗同洗一抗 6.我一般是选择ELC显影，没用过碱性磷酸酶显色法，所以没有有用的意见提供~~ 封闭是用封闭液将PVDF膜没有结合蛋白的地方封闭上，减少背景，所以摇动要缓慢，提供充足的接触，也可以不要动，或者封闭过夜都可以。洗膜时摇动剧烈可能会将一抗洗掉，所以不要过于激烈。 祝实验顺利~~ |
4楼2015-02-08 13:57:26
mulongyan
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 116.4
- 帖子: 47
- 在线: 28.3小时
- 虫号: 1983567
- 注册: 2012-09-07
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2015-05-05 22:13:38
LIVESOCCER
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 572.3
- 散金: 10
- 帖子: 419
- 在线: 109.2小时
- 虫号: 810542
- 注册: 2009-07-17
- 性别: GG
- 专业: 自然地理学
6楼2018-01-15 15:44:51
LIVESOCCER
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 572.3
- 散金: 10
- 帖子: 419
- 在线: 109.2小时
- 虫号: 810542
- 注册: 2009-07-17
- 性别: GG
- 专业: 自然地理学
7楼2018-01-21 22:23:20