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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定量PCR
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)

[求助] 定量PCR 已有10人参与

各位大神，我最近在做定量PCR，是个新手，遇到了一些问题，拜托各位指点！我的实验扩增曲线没有出现平台期，请问这是怎么回事？

定量PCR
扩增曲线.jpg


定量PCR-1
熔解曲线.jpg
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1楼 2015-01-15 12:46:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Nice melting curve.

For no stationary phase:

1. Increase PCR cycle
2. Decrease sample dilution. Are you working with cDNA/gDNA/plasmid/RNA/PCR fragment as template?
3. You said if you increase you PCR cycle, there will be some nonspecific amplification. If this is true, stop trying anything, redesign your primers and be sure there is no non-specific amplification! But your melting curve didn't show any signs of non-specificity! Any explanations?
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向钱看，向厚赚
10楼2015-01-16 00:47:46
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普通回帖

ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:06:34
明显循环数太少，才35个，曲线刚刚抬头还没到平台期，建议增加循环数到45个。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-01-15 13:02:54
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-01-15 13:02:54
明显循环数太少，才35个，曲线刚刚抬头还没到平台期，建议增加循环数到45个。

但是循环数增加后会出现非特异性扩增
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3楼2015-01-15 13:29:50
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494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:06:53
模板浓度太低了，建议减少稀释倍数
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4楼2015-01-15 13:30:31
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 494118250 at 2015-01-15 13:30:31
模板浓度太低了，建议减少稀释倍数

我的模板没有稀释啊，直接用的
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5楼2015-01-15 14:01:56
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2015-01-15 14:01:56
我的模板没有稀释啊，直接用的...

循环数应该还可以加5个或10个循环，产物特意性可以用溶解曲线去检验。模板浓度应该提高点，如果没有稀释的话，是不是可以在反转录的时候就加大RNA的量。祝好！
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6楼2015-01-15 14:43:57
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2015-01-15 14:43:57
循环数应该还可以加5个或10个循环，产物特意性可以用溶解曲线去检验。模板浓度应该提高点，如果没有稀释的话，是不是可以在反转录的时候就加大RNA的量。祝好！...

我的不是RNA，是DNA
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7楼2015-01-15 14:46:00
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:07:01
跟试剂盒有关，同时也跟你扩增的片段有关，有些试剂盒以gDNA为模板，有些片段就是没有平台期，如果以质粒或者cDNA为模板，就有平台期了。你可以试试质粒为模板做一下，应该有平台期的。
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rainwater
8楼2015-01-15 14:53:08
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-01-15 14:53:08
跟试剂盒有关，同时也跟你扩增的片段有关，有些试剂盒以gDNA为模板，有些片段就是没有平台期，如果以质粒或者cDNA为模板，就有平台期了。你可以试试质粒为模板做一下，应该有平台期的。

但是我做的绝对定量，要直接要样品DNA，不能是质粒里面的
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9楼2015-01-15 14:55:59
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