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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 懒蛋 at 2015-01-16 00:47:46
Nice melting curve.

For no stationary phase:

1. Increase PCR cycle
2. Decrease sample dilution. Are you working with cDNA/gDNA/plasmid/RNA/PCR fragment as template?
3. You said if you increa ...

我的样品没有稀释过,样品的浓度本身就很低,我用的是DNA,公司里的技术支持跟我说,如果超过35个循环,在35至40个循环内,很有可能出现非特异性扩增,这时候只要减少循环数,就可以解除这种现象,而且老师也不建议循环数过高的定量PCR。
11楼2015-01-16 08:59:41
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dqtianbin

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

12楼2015-01-18 21:11:27
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ivirus

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不知道你用的是那个公司的KIT,不过推荐天根的一个叫qRT-一步法...什么的,记不大清楚了。我当时用过,感觉还好,阳性样起峰还OK
奔三的年纪 想换个环境
13楼2015-01-18 21:34:14
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
悠悠飘杨: 金币+5, 有帮助 2015-01-22 08:53:12
提一些改进建议:第一,增加模板加入的量,第二扩大反应体系;第三;增加5个循环,不要担心引物二聚体的出现,根据你的结果来看,顶多是阴性对照出现二聚体,只要你的样本没有出现双峰就没问题;第四;添加一些DMSO等增强剂(也能改善引物二聚体情况),注意同时增加引物加入量;第五,采用好一点的试剂盒。祝好
14楼2015-01-21 11:54:13
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2015-01-16 08:59:41
我的样品没有稀释过,样品的浓度本身就很低,我用的是DNA,公司里的技术支持跟我说,如果超过35个循环,在35至40个循环内,很有可能出现非特异性扩增,这时候只要减少循环数,就可以解除这种现象,而且老师也不建议 ...

只要你的样本扩增没有引物二聚体情况,数据就可靠,不要担心这个问题,改进的方法有很多种,参考我给你的意见
15楼2015-01-21 11:55:44
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

先考虑引物与模板,其次可能和反应体系中其他试剂有关吧,
是Taq酶或是(热启动Taq酶),
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
16楼2015-01-21 15:04:27
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追求梦的人

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

多增加循环数吧,刚起来就完了,我也是平时多设循环数就好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
艰难困苦玉汝于成
17楼2015-01-21 15:37:40
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txing

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

浓度低,循环圈数少
18楼2015-01-21 16:29:44
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