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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定量PCR
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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 懒蛋 at 2015-01-16 00:47:46
Nice melting curve.

For no stationary phase:

1. Increase PCR cycle
2. Decrease sample dilution. Are you working with cDNA/gDNA/plasmid/RNA/PCR fragment as template?
3. You said if you increa ...

我的样品没有稀释过，样品的浓度本身就很低，我用的是DNA，公司里的技术支持跟我说，如果超过35个循环，在35至40个循环内，很有可能出现非特异性扩增，这时候只要减少循环数，就可以解除这种现象，而且老师也不建议循环数过高的定量PCR。
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11楼2015-01-16 08:59:41
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dqtianbin

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
12楼2015-01-18 21:11:27
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ivirus

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不知道你用的是那个公司的KIT，不过推荐天根的一个叫qRT-一步法...什么的，记不大清楚了。我当时用过，感觉还好，阳性样起峰还OK
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奔三的年纪 想换个环境
13楼2015-01-18 21:34:14
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
悠悠飘杨: 金币+5, ★有帮助 2015-01-22 08:53:12
提一些改进建议：第一，增加模板加入的量，第二扩大反应体系；第三；增加5个循环，不要担心引物二聚体的出现，根据你的结果来看，顶多是阴性对照出现二聚体，只要你的样本没有出现双峰就没问题；第四；添加一些DMSO等增强剂（也能改善引物二聚体情况），注意同时增加引物加入量；第五，采用好一点的试剂盒。祝好
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14楼2015-01-21 11:54:13
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2015-01-16 08:59:41
我的样品没有稀释过，样品的浓度本身就很低，我用的是DNA，公司里的技术支持跟我说，如果超过35个循环，在35至40个循环内，很有可能出现非特异性扩增，这时候只要减少循环数，就可以解除这种现象，而且老师也不建议 ...

只要你的样本扩增没有引物二聚体情况，数据就可靠，不要担心这个问题，改进的方法有很多种，参考我给你的意见
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15楼2015-01-21 11:55:44
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

先考虑引物与模板，其次可能和反应体系中其他试剂有关吧，
是Taq酶或是（热启动Taq酶），
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
16楼2015-01-21 15:04:27
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追求梦的人

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

多增加循环数吧，刚起来就完了，我也是平时多设循环数就好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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艰难困苦玉汝于成
17楼2015-01-21 15:37:40
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txing

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

浓度低，循环圈数少
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18楼2015-01-21 16:29:44
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