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95846713

新虫 (初入文坛)

[求助] PET28a 转化后不长菌 换pet32a 需要什么注意事项？ 已有1人参与

最近构建重组质粒，将目的片段胶回收产物与pet28a 用Bamh I 和Hind III双酶切后  经T4 DNA ligase 连接 转化至DH5α感受态细胞中，涂卡纳抗性平板，发现不长菌啊？听别人说pet28a长得慢是这样吗？  
双酶切体系：胶回收产物12 ul ，Bamh I 0.75ul，Hind III 0.75ul， 10×Butter K 1.5ul   总计  15ul     
                     pet28a  6ul ，dd 水 2ul  ，Bamh I 0.5 ul，Hind III 0.5ul ， 10×Butter K 1 ul，总计 10ul
将双酶切后的产物与per28a跑电泳，与未酶切的对比（确实切下来了），切胶回收，进行16℃过夜连接
连接体系：双酶切后的胶回收产物9ul， 双酶切后pet28a 3ul，T4 DNA Ligase 1.5 ul，10×T4 Butter 1.5 ul ，总计15ul
不知道这样的体系有没有问题？  另外看论坛上有人说连接pet28a热击36秒即可，我热击的是60秒，有影响吗？

引物设计的酶切 位点是Bamh I和Hind III， pet32a上也有这两个，我如果用换载体pet32a 需要注意什么呢？ 启动子方面注意什么？
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1楼 2014-12-23 11:09:22
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
我和你的情况是一样的，做了很久的蛋白质原核表达也没有结果。连接后转入到感受态细胞我用的是42摄氏度热激90秒。我也想换载体了，但是必须要换一个酶切位点EcoRI，所以我重新设计 了一下引物，接下来怎么做你知道吗？
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好好生活，好好工作
3楼2015-08-15 11:10:30
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
95846713(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-23 19:09:13
95846713: 金币+9 2014-12-30 18:39:54
热激时间有点长，是不是菌都烫死了？
还有热激完需要用无抗培养基复苏，这个别忘了。
最后就是卡纳霉素比较厉害，我之前这种情况都是在平板中用正常浓度的1/3或1/4。
祝成功！
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2楼2014-12-23 16:14:03
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橙橙小沫

新虫 (初入文坛)
楼主 问题解决了吗？为什么转化后在卡纳抗性平板不容易长出来呢？我也遇到了同样的问题
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4楼2017-12-06 13:28:45
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