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diguoxueye

金虫 (正式写手)

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专业: 食品加工技术

[交流] 关于果蔬中过氧化物酶与过氧化氢酶活力测定已有1人参与

我在做POD和CAT酶活力测定时发现了一些异常现象。我是采用测吸光值测定结果的。发现吸光值呈现异常变化情况。比如测CAT时发现，有的吸光值不断的下降，有的样品的吸光值先在测定的最初1min内急剧下降，随后，有的是下降速度明显降低，有的是呈增加的趋势。还有的样品是吸光值在前1分钟内先升高，随后，呈现规律的下降趋势。测定POD也出现了同样的问题。但是，以前测定POD的时候，曲线的R平方值非常大，基本上都是0.99以上的。现在和以前的最大差别在于，两次的样品不同，但是都属于同一个品种，现在测定的酶活比以前测定的小很多。
补充一点：我的分离方式采用的是过滤，而不是离心。主要是因为发现离心的效果比较差，又没有高速离心机。最后发现过滤的溶液还是比较澄清的。
下面的是POD的测定方法
7、过氧化物酶活力测定
(1) 试剂
0.02mol/L KH2PO4溶液，0.1molPH6.0磷酸缓冲液，反应混合液（取0.1mol/LPH6.0磷酸缓冲液50mL，加入愈创木酚0.028mL，于磁力搅拌器加热搅拌至溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢0.019mL，混合均匀，于冰箱中保存）。
(2) 试验方法
a) 粗酶液的提取：称取1.0g植物组织，放入研钵中，加入少量石英砂和0.02mol/L KH2PO4溶液5mL，冰浴研磨成匀浆，于4000r/min下离心15min，上清液转入25mL容量瓶中。所剩沉淀再用5mL0.02mol/L KH2PO4溶液提取一次，上清液并入容量瓶，定容至25mL，保存在冰箱备用。
b) POD测定：取比色杯2只，一只加入反应混合液3mL和0.02mol/L KH2PO4溶液1mL，作为调零空白；另一只加入反应混合液3mL和上述粗酶液1mL（如酶活力过高可稀释），立即开启秒表计时，于分光光度计470nm处比色测定吸光度，每隔1min读数一次。
c) 结果计算：以每分钟内OD470变化0.01为1个POD活力单位，计算活力：
POD活力（U/gFW/min）=
式中：△OD470——反应时间内吸光度的变化量；
W——植物组织鲜重（g）；
t——反应时间（min）；
Vt——提取酶液总体积（mL）；
Vs——测定时取用酶液体积（mL）。

CAT测定采用
样品提取是采用的磷酸盐缓冲液，测定吸光值时，2.9mLTris-HCl缓冲液+0.05mL750mmol/L过氧化氢+0.05mol/L粗酶液，在240nm下测定吸光值。每30s测定一次吸光值。

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