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q RT-PCR
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| 有做荧光定量pcr 的，用的是荧光染料sybr green 法， 在做标准曲线时，按十倍的稀释梯度稀释了8个，最后三个值退火温度小于80，我跑电泳，最后三个啥也没有，连二聚体的影子都没有，这是什么原因呢，怎么改进呢？ |
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bbqlhb
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3楼2014-12-02 16:03:08
董博士
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2楼2014-12-02 15:45:58
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
段丹: 金币+1, 嗯，很具体！ 2014-12-10 18:52:38
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
段丹: 金币+1, 嗯，很具体！ 2014-12-10 18:52:38
| 3楼说的是对的，你可以这样做，先做一个原始样本的的CT值，根据你原始样本的CT值，在决定你的稀释倍数，对于如何确定稀释倍数，你可以通过你的扩增曲线或者CT值来决定，1.CT值大于30 建议减少稀释倍数（你做8个梯度 太多了 建议做5个梯度）2.在扩增曲线上来看的话 稀释相同倍数的话 曲线的间隔一般是相同的 如果样本浓度太低还惊醒稀释的话 其扩增曲线的间隔是不一致的。至于最后三个的退火温度小于80°，分析是因为 CDNA模板浓度太低 导致QPCR扩增结果几乎没有，而形成的引物二聚（你电泳跑胶二聚体 没有 也只能说明二聚体浓度太低 胶上没有 但是QPCR仪器很灵敏 微量也能检测出来） 希望对你有用 手打不容易 |
4楼2014-12-02 17:01:32
5楼2014-12-10 18:52:15