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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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段丹

新虫 (初入文坛)

[交流] q RT-PCR

有做荧光定量pcr 的，用的是荧光染料sybr green 法， 在做标准曲线时，按十倍的稀释梯度稀释了8个，最后三个值退火温度小于80，我跑电泳，最后三个啥也没有，连二聚体的影子都没有，这是什么原因呢，怎么改进呢？
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1楼 2014-11-28 19:50:37
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董博士

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
说明后面三个的DNA浓度稀释的太低了，没有达到扩增的浓度要求
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医学&统计学
2楼2014-12-02 15:45:58
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bbqlhb

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好厉害，你的稀释倍数应该是由你的原始浓度决定的，正常来说是应该先做一孔原始样本，知道CT值再来决定稀释多少倍。
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3楼2014-12-02 16:03:08
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
★ ★
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段丹: 金币+1, 嗯，很具体！ 2014-12-10 18:52:38
3楼说的是对的，你可以这样做，先做一个原始样本的的CT值，根据你原始样本的CT值，在决定你的稀释倍数，对于如何确定稀释倍数，你可以通过你的扩增曲线或者CT值来决定，1.CT值大于30  建议减少稀释倍数（你做8个梯度 太多了 建议做5个梯度）2.在扩增曲线上来看的话  稀释相同倍数的话  曲线的间隔一般是相同的 如果样本浓度太低还惊醒稀释的话 其扩增曲线的间隔是不一致的。至于最后三个的退火温度小于80°，分析是因为 CDNA模板浓度太低 导致QPCR扩增结果几乎没有，而形成的引物二聚（你电泳跑胶二聚体 没有 也只能说明二聚体浓度太低 胶上没有 但是QPCR仪器很灵敏 微量也能检测出来） 希望对你有用 手打不容易
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生命不息奋斗不止
4楼2014-12-02 17:01:32
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段丹

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-12-02 17:01:32
3楼说的是对的，你可以这样做，先做一个原始样本的的CT值，根据你原始样本的CT值，在决定你的稀释倍数，对于如何确定稀释倍数，你可以通过你的扩增曲线或者CT值来决定，1.CT值大于30  建议减少稀释倍数（你做8个梯度 ...

嗯，谢谢啦，明白，现在还有个问题啦，我今天做另外一个基因，做了一下原始浓度的，CT 值是23，我按五倍五倍的稀释可以吗？
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5楼2014-12-10 18:52:15
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段丹

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-12-02 16:03:08
你好厉害，你的稀释倍数应该是由你的原始浓度决定的，正常来说是应该先做一孔原始样本，知道CT值再来决定稀释多少倍。

那这个额根据ct 值怎么看稀释的浓度呢，
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6楼2014-12-10 18:53:49
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bbqlhb

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 段丹 at 2014-12-10 18:53:49
那这个额根据ct 值怎么看稀释的浓度呢，...

2次扩增，然后CT值是扩增倍数，就是2的X次方（X是CT值之间的差），然后看你做什么，不同试剂有不同的，但是你可以照上面的来算。
例如：我一次实验40个循环。原始CT是23，稀释10倍的话，CT差是3.32。做5个循环，预估CT值就是23、26、29、33、36。在40的范围之内，实验方案就可行。
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7楼2014-12-11 09:08:27
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