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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求高手帮帮忙！拜托~拜托~
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su-qiong

新虫 (初入文坛)

[交流] 求高手帮帮忙！拜托~拜托~ 已有3人参与

双酶切质粒和目的片段，并分别做胶回收。之后用T4连接酶进行连接。。连接后转化挑单克隆摇菌，提质粒。提完后发现质粒的大小变小了。原来的质粒有4700多，提完后变成3000多。是怎么回事呀？急！急！急！请高手帮帮忙。谢谢~
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1楼 2014-11-21 19:31:50
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stone2239

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:04:25
提完后变成3000多，是做了单酶切电泳分析吗？如果没有做单酶切，那直接电泳肯定会比理论值偏小，因为超螺旋结构质粒会比实际质粒偏小。
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2楼2014-11-22 00:15:53
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Look_2014

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:04:34
超螺旋结构的质粒电泳时迁移率会变大，即你所说的分子量看上去好像变小了，不必太担心，如果测序结果是对的话，质粒变不变小都无所谓…

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Look
3楼2014-11-22 00:38:53
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gaolt

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:04:41
你那个原来的质粒4700多是酶切之前的还是酶切之后的，如果是酶切之前的，做一次单酶切试一次，如果是酶切后的，那肯定变小了。
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4楼2014-11-22 08:51:33
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su-qiong

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-22 00:15:53
提完后变成3000多，是做了单酶切电泳分析吗？如果没有做单酶切，那直接电泳肯定会比理论值偏小，因为超螺旋结构质粒会比实际质粒偏小。

有做单酶切验证。单酶切就是3000多。。。
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5楼2014-11-24 14:41:31
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su-qiong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Look_2014 at 2014-11-22 00:38:53
超螺旋结构的质粒电泳时迁移率会变大，即你所说的分子量看上去好像变小了，不必太担心，如果测序结果是对的话，质粒变不变小都无所谓…

跑电泳的时候使用supercolid Marker。这个是专门跑质粒的。。也有做单酶切再跑电泳。结果还是变小了。
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6楼2014-11-24 14:45:32
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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5楼: Originally posted by su-qiong at 2014-11-24 14:41:31
有做单酶切验证。单酶切就是3000多。。。...

那重新连吧，或许载体中有突变，产生了额外的酶切位点，另外你质粒来源可靠吗，有很多原因呀。
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7楼2014-11-24 19:00:03
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