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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何高保真的扩增长约4K的DNA，不引入其他杂核苷酸
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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] 如何高保真的扩增长约4K的DNA，不引入其他杂核苷酸 已有6人参与

我有段约4K的DNA序列   想扩增出来   因为要翻译成蛋白所以不能引入其它的核苷酸影响翻译   求大神赐教
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初来乍到··
1楼 2014-10-29 14:50:57
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-30 11:26:50
用高保真的酶是一定的，实在不行分成两段扩看看
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2楼2014-10-29 15:12:14
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happydove at 2014-10-29 15:12:14
用高保真的酶是一定的，实在不行分成两段扩看看

请问分成两段怎么连接到一起呀  我不想引入新的序列     用LA酶扩增特异性强不强呀。扩增序列会不会有错误
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初来乍到··
3楼2014-10-29 15:59:01
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-30 11:26:55
用高保真酶就可以了吧···
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···
4楼2014-10-29 16:00:59
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-30 11:26:59
不明白什么叫不混有杂的核苷酸？回收提纯一下不就好了？4k又不长。。。随便扩呀
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5楼2014-10-30 03:28:48
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-30 11:28:56
是4K的DNA序列还是cDNA序列啊?DNA能直接翻译蛋白质吗？用LA肯定能扩出来，但是碱基出错的可能性也很大。如果后续实验要求结果高的话，还是用高保真酶吧。
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6楼2014-10-30 09:36:44
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-10-30 09:36:44
是4K的DNA序列还是cDNA序列啊?DNA能直接翻译蛋白质吗？用LA肯定能扩出来，但是碱基出错的可能性也很大。如果后续实验要求结果高的话，还是用高保真酶吧。

我是要扩病毒的RNA反转录出的cDNA，扩增后还需要转录出RNA，RNA转染到细胞后直接作为模板翻译。所以对模板的要求较高。高保真酶可以扩4K的序列吗   会不会出错的几率也大。   正在考虑使用In-fusion   不知道哪个更好一些    请教经常做分子的高手，我是学生，所以特别不了解。还请您赐教。
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初来乍到··
7楼2014-10-30 10:55:45
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sun_in_night at 2014-10-30 03:28:48
不明白什么叫不混有杂的核苷酸？回收提纯一下不就好了？4k又不长。。。随便扩呀

嘿嘿   我说的不引入新的核苷酸就是不想用载体链接。   我的意思是用高保真酶扩4K的片段怕太长，扩出来的序列错误率高。因为我需要表达，所以不能出错。而且不能连接的时候引入其他核苷酸。高保真酶可以做到扩4K的片段出错少吗。谢谢您的耐心解答。我是分子初学者，啥也不懂。
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初来乍到··
8楼2014-10-30 10:59:22
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-30 11:29:01
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-30 14:39:54
jjsh310: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢您！ 2014-10-31 08:20:10
酶到不是最重要的，在能扩出来的情况下，循环数尽可能少点，测序的时候多测几个，一般都能拿到想要的

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-10-30 11:05:29
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-10-30 11:05:29
酶到不是最重要的，在能扩出来的情况下，循环数尽可能少点，测序的时候多测几个，一般都能拿到想要的

嗯嗯，我准备用不同的酶多扩几次测序看看，实在不行再考虑其他办法。我只是听说一般扩增片段就是1到1.5k，我的4k太大了  怕错误率太高根本没办法用。谢谢您。
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初来乍到··
10楼2014-10-30 11:10:39
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