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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何高保真的扩增长约4K的DNA，不引入其他杂核苷酸
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-30 14:40:46
引用回帖:
8楼: Originally posted by jjsh310 at 2014-10-29 14:59:22
嘿嘿   我说的不引入新的核苷酸就是不想用载体链接。   我的意思是用高保真酶扩4K的片段怕太长，扩出来的序列错误率高。因为我需要表达，所以不能出错。而且不能连接的时候引入其他核苷酸。高保真酶可以做到扩4K的 ...

一般的高保真酶能做到10k-15k只有一个碱基出错，这还是比较一般的那种。。。现在做克隆扩10k的根本不是问题，你说的1k-1.5k会出错那是指一般的酶，用来做鉴定的。一般实验室都会有专门用来做克隆的酶和一般PCR鉴定的,仔细看一下你们实验室用的酶的说明好了。
PS：还是不懂你说的“不用载体链接”什么意思，不放入载体你怎么表达你的基因呢？
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jjsh310
11楼2014-10-30 12:04:50
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by sun_in_night at 2014-10-30 12:04:50
一般的高保真酶能做到10k-15k只有一个碱基出错，这还是比较一般的那种。。。现在做克隆扩10k的根本不是问题，你说的1k-1.5k会出错那是指一般的酶，用来做鉴定的。一般实验室都会有专门用来做克隆的酶和一般PCR鉴定 ...

我是分子刚入门，而且我们实验室也很少做分子。我以为4k的长片段扩增不可以呢。所以我打算分段扩增，可是我扩出来的小片段还不知道怎么连接，所以我计划引入酶切位点再连起来。虽然很费劲，但这也是我这小小的脑容量里想出来的最好的办法了，但是这样就会引入新的核苷酸对我的序列有影响。所以我就郁闷了。。。。说明书上也没写可以扩多长的片段。。。既然您说高保真的可以那我就放心了。我再再网上仔细找找其他的说明书。万分感谢。
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初来乍到··
12楼2014-10-30 15:49:52
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jjsh310

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by sun_in_night at 2014-10-30 12:04:50
一般的高保真酶能做到10k-15k只有一个碱基出错，这还是比较一般的那种。。。现在做克隆扩10k的根本不是问题，你说的1k-1.5k会出错那是指一般的酶，用来做鉴定的。一般实验室都会有专门用来做克隆的酶和一般PCR鉴定 ...

谢谢您！
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初来乍到··
13楼2014-10-31 08:21:54
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by jjsh310 at 2014-10-30 11:10:39
嗯嗯，我准备用不同的酶多扩几次测序看看，实在不行再考虑其他办法。我只是听说一般扩增片段就是1到1.5k，我的4k太大了  怕错误率太高根本没办法用。谢谢您。...

只要你设计好引物，肯定能扩出来！这是这么长肯定会有突变序列！
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
14楼2014-11-01 16:58:23
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