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有关PCR退火温度设计的问题
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请教大家一个问题我设计的一对引物如下:F-Primer CGCTACAGCGCCGTCGCCA R-Primer GATCTCGACGCCGATGGCCTT Percent GC: 73 Percent GC: 61 Tm: 67 Tm: 64 如果严格按照引物设计原则这对引物是不符合要求的,但由于序列的原因,只能这样设计了。麻烦大家能不能推荐几个网上自动设计引物的网址?如果Tm如上面所示,那我进行PCR时退火温度应该设为多少?另外我要验证目的基因与载体连接成功与否除了菌落PCR和双酶切验证外还有没有别的方法?请各位指点迷津,谢谢! |
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http://primerdepot.nci.nih.gov/ ,我们用这个设计的引物序列; 一般选择退火温度 TM-5℃,Primer premier 5.0可以软件计算。 |

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