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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)

[交流] 有关PCR退火温度设计的问题

请教大家一个问题我设计的一对引物如下:F-Primer        CGCTACAGCGCCGTCGCCA        R-Primer        GATCTCGACGCCGATGGCCTT  
                                                                                                                   Percent GC:        73        Percent GC:        61
                                                                                                                             Tm:        67        Tm:        64
如果严格按照引物设计原则这对引物是不符合要求的,但由于序列的原因,只能这样设计了。麻烦大家能不能推荐几个网上自动设计引物的网址?如果Tm如上面所示,那我进行PCR时退火温度应该设为多少?另外我要验证目的基因与载体连接成功与否除了菌落PCR和双酶切验证外还有没有别的方法?请各位指点迷津,谢谢!
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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaokexue at 2014-11-24 15:22:38
验证转录成功与否最好的方法就是测序,PCR其实没有想象的那么难,不必拘谨与理论,以后你会发现,即使实验条件与理论不符也能做出来。还有,如果PCR不出目的产物,试试梯度PCR,一般都能做出来
...

谢谢你!
5楼2015-01-16 12:59:28
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怪叔叔推倒你

木虫 (正式写手)

http://primerdepot.nci.nih.gov/ ,我们用这个设计的引物序列;
一般选择退火温度 TM-5℃,Primer premier 5.0可以软件计算。
勤奋勇敢,善良坚韧。
2楼2014-10-24 16:51:58
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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 怪叔叔推倒你 at 2014-10-24 17:51:58
http://primerdepot.nci.nih.gov/ ,我们用这个设计的引物序列;
一般选择退火温度 TM-5℃,Primer premier 5.0可以软件计算。

谢谢!
3楼2014-10-28 16:31:37
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zhaokexue

新虫 (小有名气)

验证转录成功与否最好的方法就是测序,PCR其实没有想象的那么难,不必拘谨与理论,以后你会发现,即使实验条件与理论不符也能做出来。还有,如果PCR不出目的产物,试试梯度PCR,一般都能做出来

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-11-24 14:22:38
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