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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 有关PCR退火温度设计的问题
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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)

[交流] 有关PCR退火温度设计的问题

请教大家一个问题我设计的一对引物如下：F-Primer        CGCTACAGCGCCGTCGCCA        R-Primer        GATCTCGACGCCGATGGCCTT  
                                                                                                                   Percent GC:        73        Percent GC:        61
                                                                                                                             Tm:        67        Tm:        64
如果严格按照引物设计原则这对引物是不符合要求的，但由于序列的原因，只能这样设计了。麻烦大家能不能推荐几个网上自动设计引物的网址？如果Tm如上面所示，那我进行PCR时退火温度应该设为多少？另外我要验证目的基因与载体连接成功与否除了菌落PCR和双酶切验证外还有没有别的方法？请各位指点迷津，谢谢！
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1楼 2014-10-17 20:45:48
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zhaokexue

新虫 (小有名气)
验证转录成功与否最好的方法就是测序，PCR其实没有想象的那么难，不必拘谨与理论，以后你会发现，即使实验条件与理论不符也能做出来。还有，如果PCR不出目的产物，试试梯度PCR，一般都能做出来

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4楼2014-11-24 14:22:38
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怪叔叔推倒你

木虫 (正式写手)
http://primerdepot.nci.nih.gov/ ，我们用这个设计的引物序列；
一般选择退火温度 TM-5℃，Primer premier 5.0可以软件计算。
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勤奋勇敢，善良坚韧。
2楼2014-10-24 16:51:58
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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 怪叔叔推倒你 at 2014-10-24 17:51:58
http://primerdepot.nci.nih.gov/ ，我们用这个设计的引物序列；
一般选择退火温度 TM-5℃，Primer premier 5.0可以软件计算。

谢谢！
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3楼2014-10-28 16:31:37
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mahanxiaoa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaokexue at 2014-11-24 15:22:38
验证转录成功与否最好的方法就是测序，PCR其实没有想象的那么难，不必拘谨与理论，以后你会发现，即使实验条件与理论不符也能做出来。还有，如果PCR不出目的产物，试试梯度PCR，一般都能做出来
...

谢谢你！
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5楼2015-01-16 12:59:28
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