24小时热门版块排行榜    

查看: 2117  |  回复: 6
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

xiaot0036

铁虫 (正式写手)

[求助] 做全质粒突变的时候,成环的地方总是多出几十个bp的碱基 已有2人参与

做全质粒突变(定点突变,T变成G)的时候,成环的地方总是多出几十个bp的碱基。我认为可能是PCR反应没有立即终止,又在末尾加上了几十个碱基,导致成环后在目的基因内部插入了几十个bp的碱基。或者有其他我不知道的原因,谁有什么办法能帮帮我么?感激不尽
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaot0036

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后 ...

确实是得要模板,但是他这个情况我只是这么去假设,再找问题。测序结果是在我突变的位置后面一点有一段多出来的基因,正好是PCR结束的位置
4楼2014-10-13 14:47:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

super_mm

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后转化,筛选就好了
2楼2014-10-13 10:49:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaot0036

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后 ...

你是用重叠延伸做的吧?我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR,直接把整个质粒全部P出来,然后过柱纯化,用DPN1消化模板,再柱纯化,再转化,提质粒
3楼2014-10-13 14:22:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

super_mm

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaot0036 at 2014-10-13 14:22:11
你是用重叠延伸做的吧?我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR,直接把整个质粒全部P出来,然后过柱纯化,用DPN1消化模板,再柱纯化,再转化,提质粒...

最好不要过柱纯化,纯化的次数越多,成功率越低,我的经验是这样的,我做的时候连消化也不做,尽量不要去操作P出来的产物
5楼2014-10-13 14:56:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] filecode +5 cratir 2026-08-14 9/450 2026-08-14 12:25 by 医学老男孩
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
信息提示
请填处理意见