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xiaot0036

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[求助] 做全质粒突变的时候，成环的地方总是多出几十个bp的碱基已有2人参与

做全质粒突变（定点突变，T变成G）的时候，成环的地方总是多出几十个bp的碱基。我认为可能是PCR反应没有立即终止，又在末尾加上了几十个碱基，导致成环后在目的基因内部插入了几十个bp的碱基。或者有其他我不知道的原因，谁有什么办法能帮帮我么？感激不尽

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1楼 2014-10-12 21:50:13

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super_mm

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

我感觉你说的没有道理啊，PCR反应要继续加碱基得有模板啊，P完一圈肯定就停了啊，你是怎么做的，怎么还需要成环？我们做的时候是上下游引物有一段重叠区，突变位点就在重叠区的中间，PCR，PCR产物直接加连接酶连接后转化，筛选就好了

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2楼2014-10-13 10:49:36

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xiaot0036

铁虫 (正式写手)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊，PCR反应要继续加碱基得有模板啊，P完一圈肯定就停了啊，你是怎么做的，怎么还需要成环？我们做的时候是上下游引物有一段重叠区，突变位点就在重叠区的中间，PCR，PCR产物直接加连接酶连接后 ...

你是用重叠延伸做的吧？我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR，直接把整个质粒全部P出来，然后过柱纯化，用DPN1消化模板，再柱纯化，再转化，提质粒

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3楼2014-10-13 14:22:11

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