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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做全质粒突变的时候，成环的地方总是多出几十个bp的碱基
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xiaot0036

铁虫 (正式写手)

[求助] 做全质粒突变的时候，成环的地方总是多出几十个bp的碱基 已有2人参与

做全质粒突变（定点突变，T变成G）的时候，成环的地方总是多出几十个bp的碱基。我认为可能是PCR反应没有立即终止，又在末尾加上了几十个碱基，导致成环后在目的基因内部插入了几十个bp的碱基。或者有其他我不知道的原因，谁有什么办法能帮帮我么？感激不尽
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1楼 2014-10-12 21:50:13
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super_mm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我感觉你说的没有道理啊，PCR反应要继续加碱基得有模板啊，P完一圈肯定就停了啊，你是怎么做的，怎么还需要成环？我们做的时候是上下游引物有一段重叠区，突变位点就在重叠区的中间，PCR，PCR产物直接加连接酶连接后转化，筛选就好了
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2楼2014-10-13 10:49:36
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xiaot0036

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊，PCR反应要继续加碱基得有模板啊，P完一圈肯定就停了啊，你是怎么做的，怎么还需要成环？我们做的时候是上下游引物有一段重叠区，突变位点就在重叠区的中间，PCR，PCR产物直接加连接酶连接后 ...

你是用重叠延伸做的吧？我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR，直接把整个质粒全部P出来，然后过柱纯化，用DPN1消化模板，再柱纯化，再转化，提质粒
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3楼2014-10-13 14:22:11
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xiaot0036

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊，PCR反应要继续加碱基得有模板啊，P完一圈肯定就停了啊，你是怎么做的，怎么还需要成环？我们做的时候是上下游引物有一段重叠区，突变位点就在重叠区的中间，PCR，PCR产物直接加连接酶连接后 ...

确实是得要模板，但是他这个情况我只是这么去假设，再找问题。测序结果是在我突变的位置后面一点有一段多出来的基因，正好是PCR结束的位置
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4楼2014-10-13 14:47:17
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super_mm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaot0036 at 2014-10-13 14:22:11
你是用重叠延伸做的吧？我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR，直接把整个质粒全部P出来，然后过柱纯化，用DPN1消化模板，再柱纯化，再转化，提质粒...

最好不要过柱纯化，纯化的次数越多，成功率越低，我的经验是这样的，我做的时候连消化也不做，尽量不要去操作P出来的产物
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5楼2014-10-13 14:56:28
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我为谁狂

银虫 (小有名气)
问一下楼主找到问题的原因了吗？我也遇到了
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哈哈哈哈
6楼2019-07-01 17:02:33
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macgray1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

多出一段是正常的，重新设计下引物，就可以了
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7楼2019-07-03 11:46:48
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