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xiaot0036

铁虫 (正式写手)

[求助] 做全质粒突变的时候,成环的地方总是多出几十个bp的碱基 已有2人参与

做全质粒突变(定点突变,T变成G)的时候,成环的地方总是多出几十个bp的碱基。我认为可能是PCR反应没有立即终止,又在末尾加上了几十个碱基,导致成环后在目的基因内部插入了几十个bp的碱基。或者有其他我不知道的原因,谁有什么办法能帮帮我么?感激不尽
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super_mm

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaot0036 at 2014-10-13 14:22:11
你是用重叠延伸做的吧?我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR,直接把整个质粒全部P出来,然后过柱纯化,用DPN1消化模板,再柱纯化,再转化,提质粒...

最好不要过柱纯化,纯化的次数越多,成功率越低,我的经验是这样的,我做的时候连消化也不做,尽量不要去操作P出来的产物
5楼2014-10-13 14:56:28
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super_mm

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后转化,筛选就好了
2楼2014-10-13 10:49:36
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xiaot0036

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后 ...

你是用重叠延伸做的吧?我今天也这么做试试的。之前做的是全质粒PCR,直接把整个质粒全部P出来,然后过柱纯化,用DPN1消化模板,再柱纯化,再转化,提质粒
3楼2014-10-13 14:22:11
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xiaot0036

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 10:49:36
我感觉你说的没有道理啊,PCR反应要继续加碱基得有模板啊,P完一圈肯定就停了啊,你是怎么做的,怎么还需要成环?我们做的时候是上下游引物有一段重叠区,突变位点就在重叠区的中间,PCR,PCR产物直接加连接酶连接后 ...

确实是得要模板,但是他这个情况我只是这么去假设,再找问题。测序结果是在我突变的位置后面一点有一段多出来的基因,正好是PCR结束的位置
4楼2014-10-13 14:47:17
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