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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 离子交换过程中的困惑，算是交流吧，希望大家积极发言
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帖航

银虫 (小有名气)

[求助] 离子交换过程中的困惑，算是交流吧，希望大家积极发言 已有4人参与

我的蛋白是包涵体溶解后的变性蛋白直接用Q柱纯化，在两个盐浓度下都有目的蛋白洗脱下来（如图），我的困惑是：同一个蛋白为什么会在两个不同的盐浓度下洗脱下来？
    从电泳图上看，高浓度盐洗下来的蛋白要杂一些，会不会是这些目的蛋白和杂蛋白聚集在一起了，这样他们带的电荷要高一些，洗脱就要晚一些呢。
    我的缓冲液里有8M urea和70mM 2-Me，脲的话主要是对蛋白的氢键作用，巯基乙醇是二硫键，除了这两个键以外能使蛋白聚集在一起的就剩疏水键了。如果是疏水键作用加什么东西比较好呢。阴离子型的去垢剂肯定不行，另外，低温也不太好，一是因为我用的是pH8.0 Tris-HCl缓冲液，二是因为低温下8M脲容易结晶。
     这种情况不知道大家有没有遇见过，我的分析不知道对不对，希望这里的大神们可以给一些建议，讨论一下。

离子交换过程中的困惑，算是交流吧，希望大家积极发言
未命名.jpg
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1楼 2014-09-28 16:05:53
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zwt369

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的是线性梯度洗脱吗？就是说前后收集的两个组分里面都有目的蛋白是吗？低盐的时候可以洗脱下来一点但是没有完全洗脱，所以在高盐的时候和其他杂蛋白一起下来了吧。
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学无止尽，永远努力！
2楼2014-09-29 10:29:02
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帖航

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zwt369 at 2014-09-29 10:29:02
你的是线性梯度洗脱吗？就是说前后收集的两个组分里面都有目的蛋白是吗？低盐的时候可以洗脱下来一点但是没有完全洗脱，所以在高盐的时候和其他杂蛋白一起下来了吧。

分布洗脱，每个梯度都是5CV的洗脱体积
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3楼2014-09-29 11:09:14
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你两个盐浓度都有目的蛋白洗脱的话，说明你的目的蛋白带电量不均匀，可能一部分蛋白在复性时候构想或者表面电荷有改变。
有两个办法解决，1.你拉一下25CV的线性梯度，找到杂质峰的电导率，然后把上样盐浓度提高，做流穿。
2.换其他分离方法。
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4楼2014-09-30 14:33:03
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果能检测活性的话，测测两个组分的比活性，有可能是不同折叠的蛋白
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2014-09-30 19:46:36
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eagleeyess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感觉是包涵体变性不够彻底，变性后的蛋白带电不均一，可以考虑换盐酸胍试试，希望对你有帮助。
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6楼2014-10-11 13:30:11
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