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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白质浓度测定及活性检测
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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白质浓度测定及活性检测 已有3人参与

我纯化出来的蛋白质做两次BC A 蛋白定量，一次稀释5倍，一次稀释10倍，结果分别是4.17mg/ml，1.4mg/ml，拟合系数均在0.99以上，为什么差距会这么大呢。这下面要检测蛋白活性，不知道按照哪个算，我用了cck-8法检测细胞活性，说明书上写着，要100ul 5000个细胞，我想了解下这个怎么估计呢，难道在铺96孔板之前要把细胞悬浮，计数，然后再铺板吗？还有蛋白质稀释好后能直接放在细胞房超净台里，还是放在冰上，要不要对蛋白进行灭菌处理等，谢谢
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1楼 2014-09-23 21:35:37
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璧月

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6楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-25 20:58:49
我想问下就是再铺96孔板前细胞要长成什么情况...

我都是细胞传代时铺板。
细胞状态稳定了加药呗，长太密了药物作用容易不明显。

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7楼2014-09-25 21:41:46
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璧月

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我也遇到bca稀释后浓度不准的情况。不过我最终是按照冻干品重量浓度算的。
我是做mtt，需要对细胞进行悬浮计数，稀释到自己要的浓度。
要做到蛋白无菌，就是0.22μm过滤，加药时在超净台内操作。我因为量很少，过滤会有损失，有时会把冻干品拿到超净台，拿灭过菌的无菌水溶解，再加药，这样不能保证完全无菌，不过比在外面溶了直接用来加药要强。
你们实验室应该有人做过的，多问问呗。

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2楼2014-09-24 21:50:06
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flll2014

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-24 21:50:06
我也遇到bca稀释后浓度不准的情况。不过我最终是按照冻干品重量浓度算的。
我是做mtt，需要对细胞进行悬浮计数，稀释到自己要的浓度。
要做到蛋白无菌，就是0.22μm过滤，加药时在超净台内操作。我因为量很少，过 ...

嗯，好的，谢谢啊，请问下你在做mtt 之前，细胞培养要长满培养板，还是80%左右就可以了
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3楼2014-09-25 11:27:53
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璧月

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3楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-25 11:27:53
嗯，好的，谢谢啊，请问下你在做mtt 之前，细胞培养要长满培养板，还是80%左右就可以了...

为了得到明显的结果，贴壁就加药了，大概是铺板后24小时

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4楼2014-09-25 19:10:31
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flll2014

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 19:10:31
为了得到明显的结果，贴壁就加药了，大概是铺板后24小时
...

我养的是昆虫细胞，感觉2小时就贴壁了呢
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5楼2014-09-25 20:58:11
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flll2014

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 19:10:31
为了得到明显的结果，贴壁就加药了，大概是铺板后24小时
...

我想问下就是再铺96孔板前细胞要长成什么情况
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6楼2014-09-25 20:58:49
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flll2014

铜虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 21:41:46
我都是细胞传代时铺板。
细胞状态稳定了加药呗，长太密了药物作用容易不明显。
...

嗯，是的，我发现了，我做了浓度梯度，可是梯度之间没有差异，只是处理组与对照组有差异，请问下你是用什么软件处理酶标仪读出的数据呢
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8楼2014-09-26 09:43:10
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璧月

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8楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-26 09:43:10
嗯，是的，我发现了，我做了浓度梯度，可是梯度之间没有差异，只是处理组与对照组有差异，请问下你是用什么软件处理酶标仪读出的数据呢...

刚开始做，只用了excel
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9楼2014-09-26 10:48:04
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偶尔哼哼的猪

新虫 (小有名气)
★
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我测的时候也出现了稀释浓度后吸光度不准的现象，不知除了用冻干的蛋白算浓度，还用过什么方法解决这个问题？
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10楼2015-10-09 16:39:35
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