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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白质浓度测定及活性检测 已有3人参与

我纯化出来的蛋白质做两次BC A 蛋白定量,一次稀释5倍,一次稀释10倍,结果分别是4.17mg/ml,1.4mg/ml,拟合系数均在0.99以上,为什么差距会这么大呢。这下面要检测蛋白活性,不知道按照哪个算,我用了cck-8法检测细胞活性,说明书上写着,要100ul 5000个细胞,我想了解下这个怎么估计呢,难道在铺96孔板之前要把细胞悬浮,计数,然后再铺板吗?还有蛋白质稀释好后能直接放在细胞房超净台里,还是放在冰上,要不要对蛋白进行灭菌处理等,谢谢
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璧月

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6楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-25 20:58:49
我想问下就是再铺96孔板前细胞要长成什么情况...

我都是细胞传代时铺板。
细胞状态稳定了加药呗,长太密了药物作用容易不明显。

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7楼2014-09-25 21:41:46
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璧月

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我也遇到bca稀释后浓度不准的情况。不过我最终是按照冻干品重量浓度算的。
我是做mtt,需要对细胞进行悬浮计数,稀释到自己要的浓度。
要做到蛋白无菌,就是0.22μm过滤,加药时在超净台内操作。我因为量很少,过滤会有损失,有时会把冻干品拿到超净台,拿灭过菌的无菌水溶解,再加药,这样不能保证完全无菌,不过比在外面溶了直接用来加药要强。
你们实验室应该有人做过的,多问问呗。

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2楼2014-09-24 21:50:06
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flll2014

铜虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-24 21:50:06
我也遇到bca稀释后浓度不准的情况。不过我最终是按照冻干品重量浓度算的。
我是做mtt,需要对细胞进行悬浮计数,稀释到自己要的浓度。
要做到蛋白无菌,就是0.22μm过滤,加药时在超净台内操作。我因为量很少,过 ...

嗯,好的,谢谢啊,请问下你在做mtt 之前,细胞培养要长满培养板,还是80%左右就可以了
3楼2014-09-25 11:27:53
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璧月

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3楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-25 11:27:53
嗯,好的,谢谢啊,请问下你在做mtt 之前,细胞培养要长满培养板,还是80%左右就可以了...

为了得到明显的结果,贴壁就加药了,大概是铺板后24小时

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4楼2014-09-25 19:10:31
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flll2014

铜虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 19:10:31
为了得到明显的结果,贴壁就加药了,大概是铺板后24小时
...

我养的是昆虫细胞,感觉2小时就贴壁了呢
5楼2014-09-25 20:58:11
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flll2014

铜虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 19:10:31
为了得到明显的结果,贴壁就加药了,大概是铺板后24小时
...

我想问下就是再铺96孔板前细胞要长成什么情况
6楼2014-09-25 20:58:49
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flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 璧月 at 2014-09-25 21:41:46
我都是细胞传代时铺板。
细胞状态稳定了加药呗,长太密了药物作用容易不明显。
...

嗯,是的,我发现了,我做了浓度梯度,可是梯度之间没有差异,只是处理组与对照组有差异,请问下你是用什么软件处理酶标仪读出的数据呢
8楼2014-09-26 09:43:10
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璧月

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8楼: Originally posted by flll2014 at 2014-09-26 09:43:10
嗯,是的,我发现了,我做了浓度梯度,可是梯度之间没有差异,只是处理组与对照组有差异,请问下你是用什么软件处理酶标仪读出的数据呢...

刚开始做,只用了excel
9楼2014-09-26 10:48:04
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偶尔哼哼的猪

新虫 (小有名气)


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我测的时候也出现了稀释浓度后吸光度不准的现象,不知除了用冻干的蛋白算浓度,还用过什么方法解决这个问题?
10楼2015-10-09 16:39:35
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