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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 琼脂糖凝胶上回收PCR产物
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190582353

木虫 (小有名气)

[交流] 求助 琼脂糖凝胶上回收PCR产物

用PCR产物回收试剂盒尝试从琼脂糖凝胶上回收PCR 产物，但每次用回收的溶液再次电泳都得不到条带，我用的是无菌水洗脱，时间为20分钟，洗脱前55度预热， 同时尝试过TE（PH约为8）仍然得不到条带。哪位高手做过类似的实验，请赐教，不胜感激！
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1楼 2008-04-18 15:15:41
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU
可能是量少吧，电泳的时候检测不到。试剂盒回收按照提供的步骤一般问题不大的。
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活着就要让人感受到你的存在。
2楼2008-04-18 15:21:21
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guo1983752

银虫 (初入文坛)
你用的什么试剂盒啊？
一般的试剂盒都配有洗脱液啊！我从来都是用专门的洗脱液
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3楼2008-04-18 15:47:02
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hfztim

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
asr(金币+3,VIP+0):谢谢,辛苦了。欢迎常来 :-)
可能的原因：1.你的琼脂糖凝胶溶化了吗？一般要溶个10分钟左右。
2.洗脱时用的水量是不是太多？一般用20ul就可以了。
3.回收的溶液再次电泳时取了几微升上样？一般要5ul左右。
另外PCR产物一般情况下不需要琼脂糖凝胶回收的，你可以按这个方法做：
1.PCR产物转移至1.5ml离心管，加TE至400ul，加2倍乙醇和1/10乙酸钠，12000rpm 5m
2.75%乙醇洗涤，加TE溶解即可。
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4楼2008-04-18 17:39:46
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
两点建议：
1、把说明书再仔细研究一下，确定每一步都没有疑问了再做
2、回收的过程保证干净、无污染
    回收很少会出问题的，即使有问题也是很容易就可以找到原因的，不会浪费较多的时间，加油哦！
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5楼2008-04-18 19:03:26
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
用水或者专门的buffer都是一样的，专用的buffer里面有一些影响后面实验的因素存在。胶回收是个很常规的实验，做不出来应该在试剂盒或者操作上面。仔细研究夏过程，有可能出问题的环节：
1、胶的溶解是否彻底
2、wash buffer里面是否加了乙醇
常规实验。。。。。。残念。
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For my life！
6楼2008-04-18 22:05:54
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figo.339

木虫 (著名写手)
应该是你的条带太弱了。
还有就是最后加TE或无菌水洗脱时量多了，因为一般的试剂盒都是没有问题的。
建议你在看看试剂盒上的说明书，还有就是加70%乙醇离心后时要放置2分钟再加洗脱液。
点样时量加大些，有时回收的浓度小点样是跑的不明显！
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7楼2008-04-19 09:49:57
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weiyue

个人一点建议

我也遇到过上述问题,用的是Takara回收试剂盒,回收不到。后来直接将PCR产物与质粒连接，菌落培养， PCR检测出带有目的条带的菌落，进行测序，就OK了。
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8楼2008-04-21 11:25:03
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
是不是是不是量少啊
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9楼2008-04-21 11:34:23
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
我来学习一下
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10楼2008-04-21 11:35:44
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