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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有关连接转化问题，求大神指导！！快来救救菜鸟吧。
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

[求助] 有关连接转化问题，求大神指导！！快来救救菜鸟吧。 已有1人参与

我扩了两个片段，分A为4Kb,B为3.8Kb的，想把它们俩连接到PMD18-T中，用的是TAKARA的SolutionⅠ，T4也用过，连接后转化，A片段不长斑，B片段长斑正常。但用菌液PCR和提质粒，最后B片段的大小均为2000bp左右，我想问这是什么情况？不长斑？长得斑片段大小不对……纠结死了！求大神解救。
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1楼 2014-09-05 08:39:43
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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koreyoshitan: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-05 14:57:41
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-05 17:19:39
koreyoshitan: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-06 09:19:52
按照摩尔比（载体和片段1:3）好好的计算一下，4kb连接到2.7kb的PMD18 载体里 如果载体加0.5ul（25ng）l的话，总的片段浓度就需要113ng, 3.8kb的差不多也要那个浓度，

B片段你可以用M13通用引物进行扩增，比你要的要大150bp左右，如果扩增出来还是2000多，那么你这个片段就没连接上去，

另外，不确定你用的什么不是加A尾的酶，用高保真的酶扩增的话要添加A尾。
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koreyoshitan
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2楼2014-09-05 09:18:27
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-05 09:18:27
按照摩尔比（载体和片段1:3）好好的计算一下，4kb连接到2.7kb的PMD18 载体里 如果载体加0.5ul（25ng）l的话，总的片段浓度就需要113ng, 3.8kb的差不多也要那个浓度，

B片段你可以用M13通用引物进行扩增，比你要的 ...

还有，体系需要把握好，10ul的体系，solutionI是需要一半体积的。像总浓度需要很高的片段，方法就是多扩增几管做胶回收，争取把浓度弄上来，这样就好做多了。
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3楼2014-09-05 09:20:47
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-05 09:18:27
按照摩尔比（载体和片段1:3）好好的计算一下，4kb连接到2.7kb的PMD18 载体里 如果载体加0.5ul（25ng）l的话，总的片段浓度就需要113ng, 3.8kb的差不多也要那个浓度，

B片段你可以用M13通用引物进行扩增，比你要的 ...

我想知道有关A尾的问题，不太懂，我是用的HIFI酶
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4楼2014-09-05 14:57:23
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-05 17:19:49
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 18:16:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by koreyoshitan at 2014-09-05 14:57:23
我想知道有关A尾的问题，不太懂，我是用的HIFI酶...

PMD系列的载体，切好后两端都是加T的，你扩增的片段能够连接上去的原因是因为DNA聚合酶给你两端都加了A，所以才能互补连接上去，如果是高保真酶，扩增出来的片段都是平末端，两端没有A尾，这样的话你得自己加A尾，加A尾很简单， 平末端片段，rtaq或者其他加A尾的酶，对应的buffer，dNTP,  水，72度延伸20分钟就可以了。

你去看一下HIFI说明书，如果扩增的片段式平末端那是要加A尾的。
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5楼2014-09-05 15:22:07
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-05 15:22:07
PMD系列的载体，切好后两端都是加T的，你扩增的片段能够连接上去的原因是因为DNA聚合酶给你两端都加了A，所以才能互补连接上去，如果是高保真酶，扩增出来的片段都是平末端，两端没有A尾，这样的话你得自己加A尾， ...

带A尾。我在努力努力！
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6楼2014-09-06 09:19:41
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
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7楼2014-09-10 09:34:40
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by koreyoshitan at 2014-09-10 09:34:40
大神，我还是做不出来，体系也变了，载体，模版都换了，还是不长。...

你的感受态细胞没什么问题吧？有没有测胶回收的片段浓度啊？我给你份PGEM-T的说明书，你好好看看。
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8楼2014-09-10 09:55:30
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 18:16:19
好好看下。
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9楼2014-09-10 09:56:10
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-10 09:56:10
好好看下。

PGEM-T和PMD-T的序列差不多，你可以看下注意事项和疑难解答。
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10楼2014-09-10 09:57:36
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