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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

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[求助] 有关连接转化问题，求大神指导！！快来救救菜鸟吧。已有1人参与

我扩了两个片段，分A为4Kb,B为3.8Kb的，想把它们俩连接到PMD18-T中，用的是TAKARA的SolutionⅠ，T4也用过，连接后转化，A片段不长斑，B片段长斑正常。但用菌液PCR和提质粒，最后B片段的大小均为2000bp左右，我想问这是什么情况？不长斑？长得斑片段大小不对……纠结死了！求大神解救。

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1楼 2014-09-05 08:39:43

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koreyoshitan

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-05 09:18:27
按照摩尔比（载体和片段1:3）好好的计算一下，4kb连接到2.7kb的PMD18 载体里如果载体加0.5ul（25ng）l的话，总的片段浓度就需要113ng, 3.8kb的差不多也要那个浓度，

B片段你可以用M13通用引物进行扩增，比你要的 ...

我想知道有关A尾的问题，不太懂，我是用的HIFI酶

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4楼2014-09-05 14:57:23

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koreyoshitan

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5楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-05 15:22:07
PMD系列的载体，切好后两端都是加T的，你扩增的片段能够连接上去的原因是因为DNA聚合酶给你两端都加了A，所以才能互补连接上去，如果是高保真酶，扩增出来的片段都是平末端，两端没有A尾，这样的话你得自己加A尾， ...

带A尾。我在努力努力！

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6楼2014-09-06 09:19:41

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