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koreyoshitan金虫 (初入文坛)
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有关连接转化问题，求大神指导！！快来救救菜鸟吧。 已有1人参与
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| 我扩了两个片段，分A为4Kb,B为3.8Kb的，想把它们俩连接到PMD18-T中，用的是TAKARA的SolutionⅠ，T4也用过，连接后转化，A片段不长斑，B片段长斑正常。但用菌液PCR和提质粒，最后B片段的大小均为2000bp左右，我想问这是什么情况？不长斑？长得斑片段大小不对……纠结死了！求大神解救。 |
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koreyoshitan
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按照摩尔比（载体和片段1:3）好好的计算一下，4kb连接到2.7kb的PMD18 载体里 如果载体加0.5ul（25ng）l的话，总的片段浓度就需要113ng, 3.8kb的差不多也要那个浓度， B片段你可以用M13通用引物进行扩增，比你要的要大150bp左右，如果扩增出来还是2000多，那么你这个片段就没连接上去， 另外，不确定你用的什么不是加A尾的酶，用高保真的酶扩增的话要添加A尾。 |
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koreyoshitan
2楼2014-09-05 09:18:27
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