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hongkaichen金虫 (小有名气)
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[交流]
求助，关于DNA提取问题。
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我想问下，我用CTAB法提取真菌DNA（菇类，还有一些其他的真菌）提出的带经常是好长的尾巴，但要的DNA好像没有。 我的CATB法是这样的，先用液氮研磨（菇类的不好研）有时也用烘干后研磨的粉末，然后加入预热的CTAB缓冲液（用粉末的时候还加入过蛋白酶K，用液氮研磨的时候也加过），65度水浴30分钟，有时也水浴过2个小时或更长时间，然后就是12000g离心5分钟，取上清加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），有时也直接用氯仿提，再12000g离心5分钟，取上清，重复上一步2-3次，直到没有蛋白质为止，然后加入2倍体积的乙醇和1/10体积的醋酸铵（由于没有醋酸铵加的是），静置10分钟，12000g离心10分钟，弃上清，用百分之70的乙醇清洗 ，再用TE溶解，再跑电泳，跑出来的带如图，有一次担到了但杂质特多，希望哪位好人能帮忙解释下！！谢谢！！ [ Last edited by hongkaichen on 2008-4-18 at 18:09 ] |
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真菌基因组DNA的长度在几十到几百kb左右不等，从你电泳图可以看出DNA碎片太多，左边加样孔的样品里可能有糖类等残留物质。见议：1.你用λ-DNA做MARKER 2.提取时动作要温柔 3. 第一次看到絮状沉淀时用牙签挑取DNA，最好不要通过离心得到DNA(可能有一些多糖也一起沉淀了)，再进行后续的纯化。 给你一个方法作为参考： 1.液氮研碎，加CTAB缓冲液，60度1小时以上。 2.加等体积酚、氯仿，10000rpm 5min 3.上清加2/3体积异丙醇，12000rpm 5min 4.沉淀加含RNA酶的TE 37度溶解半小时 5.用等体积酚、氯仿，12000rpm 5min 用等体积氯仿，12000rpm 5min 6.加1/10体积乙酸钠，两倍无水乙醇，12000rpm 5min 7.沉淀用75%乙醇洗，溶解即可。 [ Last edited by hfztim on 2008-4-18 at 11:46 ] |
8楼2008-04-18 11:44:14
hongkaichen
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