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流式细胞术，对照设置 已有2人参与
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大神好。最近在做流式，由于是新手，好多东西不明白。我在检测我做的稳转细胞系中细胞阳性率有多少，也就是纯不纯。阴性对照怎么设啊，我用的是没有转入目的蛋白的细胞染的一抗和二抗，效果很不理想啊。不知道是不是对照设的有问题 另附上实验方法，看看步骤是不是哪里需要改进的。 1. 收集细胞，Staining Buffer清洗细胞，最后剩100μL，涡旋重选细胞 2. 加入100μL固定液(4%多聚甲醛)，室温孵育20min 3. 加入500μL破膜液（0.1%皂素），300-400g，室温离心5min，弃上清 4. 500μL破膜液重悬细胞 5. 300-400g，室温离心5min，弃上清 6. 100μL破膜液重悬细胞，加入一抗，孵育1h 7. 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清 8. 重复步骤7 9. 100μL破膜液重悬细胞，加入荧光偶联抗体孵育30min 10. 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清 11. 重复步骤10 12. 用适量流式染色Buffer（PBS）重悬，上流式细胞仪分析。 PS: Staining Buffer：1%BSA or 5%FBS的1×PBS Fix Buffer：4%多聚甲醛的1×PBS 0.22μm滤器过滤 一抗：1h 二抗：30min |
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