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zisejiguan

铜虫 (小有名气)

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[求助] 流式细胞术，对照设置已有2人参与

大神好。最近在做流式，由于是新手，好多东西不明白。我在检测我做的稳转细胞系中细胞阳性率有多少，也就是纯不纯。阴性对照怎么设啊，我用的是没有转入目的蛋白的细胞染的一抗和二抗，效果很不理想啊。不知道是不是对照设的有问题

另附上实验方法，看看步骤是不是哪里需要改进的。

1. 收集细胞，Staining Buffer清洗细胞，最后剩100μL，涡旋重选细胞
2. 加入100μL固定液(4%多聚甲醛)，室温孵育20min
3. 加入500μL破膜液（0.1%皂素），300-400g，室温离心5min，弃上清
4. 500μL破膜液重悬细胞
5. 300-400g，室温离心5min，弃上清
6. 100μL破膜液重悬细胞，加入一抗，孵育1h
7. 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清
8. 重复步骤7
9. 100μL破膜液重悬细胞，加入荧光偶联抗体孵育30min
10. 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清
11. 重复步骤10
12. 用适量流式染色Buffer（PBS）重悬，上流式细胞仪分析。

PS: Staining Buffer：1%BSA or 5%FBS的1×PBS
Fix Buffer：4%多聚甲醛的1×PBS 0.22μm滤器过滤
一抗：1h
二抗：30min

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