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wangzhongl银虫 (小有名气)
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[求助]
流式细胞仪检测荧光强度，不知道一些参数设置? 还请各位多多指导，很急，谢谢！ 已有1人参与
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请问各位虫友，我用流式细胞仪检测荧光强度，不知道流式的 一些参数设置? 还请各位多多指导，很急，谢谢！ |
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2楼2014-03-03 00:12:14
yipan 
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【答案】应助回帖
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荧光补偿设置 荧光渗漏是绝大多数多色实验中不可避免的，很容易发生，需要在随后的数据中通过补偿方法将这些影响去掉。最后的结果是，无论细胞群体在别的通道内荧光如何，在一个通道内荧光强度相同的不同细胞群体其平均荧光强度相似。尽管多数模拟制流式细胞仪具有荧光补偿电路，但需要注意的是荧光补偿是与实验密切相关的，而非是一种仪器设置。各个荧光探测器增益一旦确定后，荧光补偿设置也变得很直观，因为各个荧光渗漏很容易检测到。但荧光补偿操作会使阴性群体在一个或多个补偿过的荧光通道中分布分散，但这图形比未经补偿的数据容易分析得多。检测荧光补偿调节是否正确需使用某些对照品，最常用的是一组微球或细胞样本--荧光抗体单染某个标志物后检测。通过仪器本身或软件可计算出正确的荧光补偿。荧光补偿设置一定是在PMT电压设定以后进行，因为荧光补偿的多少程度与电压直接相关。然而一些新流式用户由于经验问题没有能力在PMT电压发生改变后去重新调节荧光补偿。 在许多情况下，使用单染样本作为补偿对照是有效的。这种方法的缺点是必须在原样本中抽取些细胞或另外寻找细胞来源。第二年缺陷是，当检测指标是弱阳性/阴性或只有极少细胞表达，这时依靠抗体染色调节补偿就变得十分困难。如遇这种情况，可使用相同荧光标记的其他抗体来染色作为补偿对照。实际上，许多研究者都使用一种抗体，如CD8（在某些细胞群体上强阳性表达）来调节各个通道的荧光补偿。在多数情况下这是一种完美的方法，因为通过相等或更强的荧光信号可精确调节补偿。 在调节某些复合荧光素的补偿时难度会很大，特别的APC-Cy7和PE-Cy7。这些荧光素发射波长的批间差异比较大，会影响荧光渗漏的稳定性，同时它们还受抗体保存和样本染色的影响。当使用这些荧光素时，使用不同的抗体来调节补偿可能会影响荧光补偿的精确性。 有两种类型的微球可用于染色细胞的荧光补偿调节：标记有荧光素的微球，或是能够捕获用户所有荧光抗体的微球。前一种微球标有稳定的荧光素在许多检测中可方便使用，通常它是由厂家配套相关的软件自动调节荧光补偿，多见于临床检验科中使用。然而当在实验中使用APC-Cy7 或PE-Cy7荧光时，这些样本由于受上面介绍的因素影响，很难在各通道中精确调节荧光补偿。因此如果实验中使用这两个荧光素需十分小心。 捕获微球具有以上两种方法优点：它们像细胞一样与抗体结合，但因为它们与抗体结合没有特异性，所以它们与细胞不同，可为各抗体提供强烈、统一的荧光信号来调节补偿。并且很少出现细胞染色信号强于捕获微球的情况。捕获微球还能与染色样本在同一实验条件下进行操作（固定、破膜、温度、曝光），此法对于复合荧光素也具有高灵敏度。使用捕获微球的主要注意点是它们的光散射门与细胞不同，另外它们只捕获某些亚型的抗体（如标有抗小鼠kappa轻链的微球难与小鼠抗体结合）详情见BD Biosciences公司资料。故如要使用这些微球来进行补偿调节需要对捕获微球及抗体有充分的了解。 |
3楼2014-03-03 09:30:47
wangzhongl
银虫 (小有名气)
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4楼2014-03-05 15:51:45