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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » western小白求助-内参相关
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仲尼

新虫 (小有名气)

[求助] western小白求助-内参相关 已有4人参与

本人第一次做western，还在摸索中，希望有经验的虫友帮忙：
关于内参的使用方法（本人可以查到的）如下，选哪种方法更合理和保险呢，希望大神帮忙。
①同时跑两个胶，一个转膜后，用来孵育目标蛋白抗体；另一个转膜后，用来孵育内参抗体。
②跑一个胶，转膜后，先孵育目标蛋白抗体。然后，直接孵育内参抗体。
③现在有专门的抗体去除液，可以实现用同一个膜：孵育完目标蛋白抗体，并显色；用去除液去除抗体，再孵育内参抗体，显色。

注：我的目标蛋白是一种细胞膜蛋白，分子量有好多个27,43,47,67,55,117KDa；内参用的是GAPDH（37KDa）

另外，我想定性我的目标蛋白，这需要在转完膜后将膜染色，然后跟蛋白Marker对比吗？还是到发光那一步，目标条带和Marker都会跑到X光片上？
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1楼 2014-08-16 18:19:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

仲尼

新虫 (小有名气)
没人理我，自己顶一下自己
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2楼2014-08-18 08:28:07
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普通回帖

zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
仲尼: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-18 14:47:31
跑一个胶，转一个膜，转膜后根据内参的大小把相应的膜剪下来，根据你说的情况你的目的蛋白跟GADPH是能够分开的~
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3楼2014-08-18 11:28:18
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景宿

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
仲尼: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-18 14:47:39
可以先敷目的蛋白，然后使用洗脱液洗去之后再孵育内参，因为一般内参都是比较容易出的，所以可以后敷
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4楼2014-08-18 14:28:53
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 景宿 at 2014-08-18 14:28:53
可以先敷目的蛋白，然后使用洗脱液洗去之后再孵育内参，因为一般内参都是比较容易出的，所以可以后敷

洗脱液的效果怎么样？担心把膜上的蛋白洗掉，这样就增加了误差啊，内参本来就是矫正上样误差的嘛。
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5楼2014-08-18 14:47:16
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zero19871029 at 2014-08-18 11:28:18
跑一个胶，转一个膜，转膜后根据内参的大小把相应的膜剪下来，根据你说的情况你的目的蛋白跟GADPH是能够分开的~

这样的话，我的膜是不是得剪成3部分，因为有大于内参和小于内参的目的蛋白
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6楼2014-08-18 14:50:34
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“我的目标蛋白是一种细胞膜蛋白，分子量有好多个27,43,47,67,55,117KDa”，你确定你的抗体能把你的目的蛋白显成marker一样？  
先做一下你的目的蛋白，看看在显影成什么模样，如果能和GAPDH分开，就是一张膜，剪开分别孵育抗体。
如果不能分开，或者你不确定你剪得好，那就是先孵育目的蛋白抗体，完了后，洗了再孵育内参。
不建议两张膜一张目的蛋白，一张内参。
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7楼2014-08-18 17:17:18
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zero19871029

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 仲尼 at 2014-08-18 14:50:34
这样的话，我的膜是不是得剪成3部分，因为有大于内参和小于内参的目的蛋白...

是的~
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8楼2014-08-18 17:30:52
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景宿

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 仲尼 at 2014-08-18 14:47:16
洗脱液的效果怎么样？担心把膜上的蛋白洗掉，这样就增加了误差啊，内参本来就是矫正上样误差的嘛。...

我们之前实验室就是这样做的，洗脱时间一般10分钟，没有出现过洗掉蛋白的现象
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9楼2014-08-20 11:39:05
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hl5210

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zero19871029 at 2014-08-18 11:28:18
跑一个胶，转一个膜，转膜后根据内参的大小把相应的膜剪下来，根据你说的情况你的目的蛋白跟GADPH是能够分开的~

能不减下来吗？
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10楼2014-10-09 10:00:58
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